Hier eine kurze Einleitung in das Thema Prumm-Vorbereitung und Gewebefixierung.
Der Ablauf des Probenprozessierung ist weitestgehend mal gleich.
Sie entnehmen zuallererstes Gewebe. Das sind Bioptien, flüssige Entnahmen
eben aus Blut oder Urinn oder beispielsweise gynäkologische Abstriche etc. pp.
Wenn wir das Ganze zwischengelagert in Love-Dom-Clourid oder in irgendwelchen Puffer-Lösungen und dann wird es fixiert,
weil das Gewebe, wenn es nicht fixiert wird,
üblicherweise nach kurzer Zeit anfängt,
autolytische Prozesse in Gang zu setzen, die dann dazu führen,
dass man mit dem Gewebe keine Analytik mehr betreiben kann.
Dann wird das Ganze gelagert und später weiter prozessiert,
geschnitten,
nachfixieren und Gefährt
Ganz wichtig an der Stelle, die Fixierung mit Formalin hat gewisse Konsequenzen für das.
Und wir machen mal einmal einen kurzen Überblick über die Fixierung,
die wir so anwenden, die man kennt und die wichtig sind.
Das ist einmal ganz vorneweg die Form erhöht oder Paraform,
alte Hydfixierung. Die findet auch in der Histologie,
in der Immunhistochemie statt und das Ganze basiert hier auf eine Quervernetzung aller Biomoleküle in den Zellen,
die dann zu einer gewissen Stabilität und zur Einstellung der Lebensprozesse
quasi führt und dadurch die Autolyse und Zersetzung des Gewebes verhindert.
Als zweites ebenfalls häufig eingesetztes Fiktierungskonzept wird die Crio-Konservierung verwendet.
Das findet man in Schnellschnellschnitten und alles unter 30 Grad kann man quasi,
also unter minus 30 Grad, kann man als Crio-Konservierung bezeichnen.
Dann gibt es weitere Quervernetzung zu Mitteln,
die überwiegend in der Elektronenmikroskopie verwendet werden.
Das ist beispielsweise das Blutalhüt, auch das quervernetzt.
Und dann gibt es Denaturierende, Reagenzien wie Alkohol oder Acetone,
zum Beispiel in der Zelldiagnostik, also Zytodiagnostik.
Und die basieren eben auch der Denaturierung und der Dehydratisierung
von ihren Proben
Was bedeutet eigentlich die Naturierung, dass an der Stelle ganz wichtig,
Koabulation, und zwar eine irreversible Einstellung aller chemischen,
biochemischen Funktionen oder biologischen Funktionen durch die Zerstörung von allen Sekundär und Herstrukturen der Proteine.
Hierbei werden die die so Feedbrücken aufgebrochen. Das Protein entfaltet sich in
einer jeweiligen Publit-Kette. Und die Primärstruktur bleibt dementsprechend vorhanden.
Es werden weiterhin Wasserstoffbrücken gelöst, aber auch wieder neu gebildet.
Und dadurch können sich unterschiedliche, dem nativen Zustand widersprüchliche THCR-Strukturen wählen.
Das wiederum hat Einfluss auf die Löslichkeit. Und ein
schönes Beispiel ist hier zum das Ei oder die Milch.
Und wir wissen, dass Ei beispielsweise verändert, seine Struktur beim Kochen.
Oder auch wenn sie es in eine saure Lösung gibt, Assistentaturierung.
Hier werden die ursprünglichen Teststrukturen aufgebrochen, also beim Kochen beispielsweise
durch die Hitze. Und danach durch Wasserstoffbrückenwindung neue THCR-Strukturen gebildet,
die dann die Blöslichkeit des jeweiligen Proteins verändern.
Und dadurch wird das Protein, das Eihard und bei der Milch,
was auch ein bisschen schöner, anschaulicher dargestellt ist,
kippen sie mal ein bisschen Zitronensäure oder einfach Zitronensaft in Med
Da kommt es dann zu einer chemischen, die Naturierung hier
durch Säuren beispielsweise. Und da flockt dann das Milchprotein aus,
weil es eben einmal denaturiert wird und dann ein neues Brücken gebildet.
Und dann ist dieses Protein aber eben nicht mehr löslich im
Wasser und fällt aus. Und dadurch gerinnt die Milch.
Genau, im Großen und Ganzen gibt es zwei Möglichkeiten,
physikalische Denaturierung. Und ich chemische Denaturierung, physikalisch hat man
jetzt bei dem Ei schon mal mit der Temperatur besprochen.
Dazu kommt das Thema Druck. Energiereiche Strahlung gibt es auch
noch. Und in der chemischen Denaturierung sind es euren Laugen,
Alkohole und Ditagenzen,
die da
eine Rolle spielen
So, auf dieser Folie konzentrieren wir uns einmal auf das Thema Form Alehüth und die Quervernetzung,
das ist eine der üblichsten Fixierungsmethoden vom Alehüt des CH2O oder auch methanal
ist das einfachste Alehüt, was es gibt.
Es kommt natürlich vor, in Säugertierzellen als Stoffwechselprodukt oder Zwischenprodukte
in der Fotoauxidation, bei Verbrennung von organischen Substanzen,
in Fruchtsorten im Holz und so weiter und so fort.
Das heißt, die finden das schon ziemlich häufig
auch im physiologischen und natürlichen Kontext.
Üblicherweise liegt vom Alehüt bei Raumtemperatur als Gas vor.
Und wenn sie es zum Fixieren benutzen und kaufen,
dann haben sie üblicherweise
einen 37 bis 38 Prozent
Dicke, promitige Lösung. Zu verwenden wiederum verwendet man dann 4 bis 5 oder 8 bis 10-prozentige Lösungen,
die dann einfach Malin bezeichnen werden, um ganz,
ganz wichtig ist, dass sie wissen,
dass das Ganze diffusionsabhängig ist und sie eine Eindringgeschwindigkeit haben,
und zwar von einem Millimeter pro Stunde.
Das heißt, wenn sie irgendwie ein Gewebe Sampel haben,
was sie fixieren möchten,
dann sollten sie entweder die Größe des Gewebes anpassen oder eben die Zeit,
wie lange sie fixieren und sich hier dran orientieren.
Das, was passiert bei der Formalinfizierung, chemische Quervernetzung unter
Ausbildung von dem Methylbrücken. Und diese Methylbrückenbildung ist im Prinzip
ein Prozess, der das Fixitive verbraucht. Das heißt also,
es geht nicht unendlich weit, sodass wir nur angeguckt,
sondern tatsächlich verwenden sie das Methanal, um diese Brücken zu bauen.
Die Brücken verbindet Proteine untereinander, nukleinsäuren untereinander oder eben auch Proteine und Nukleoninsäuren untereinander.
Dadurch kommt es zu einer starren Verbindung aller Biomoneküle in der Zelle,
die es unmöglich macht, dass nordweite Prozesse stattfinden und dadurch das Gewebefiziert wird.
Sie können sich vorstellen, dass die Strukturen der Proteine und der Nukleinsäuren
dadurch Veränderungen erfahren, diese Veränderung, nennt man Maskierung.
Und wenn sie zum Beispiel bei einer Antikörperfärbung mal mit einem Antikörper nicht besonders erfolgreich sind,
dann versuchen sie eine Antigendemaskierung, das heißt,
die knacken unter Umständen mit gewissen Boden,
diese Methylenbrücken wieder auf und können das Antigen beziehungsweise das Epitop eines Proteins wieder zugänglich machen, dass ein Antikörper dort binden kann.
Grundsätzlich sei noch zu sagen, dass Formalien in höheren Konzentrationen
neigt Polymere zu binden und wenn sie mehr als 100 Polymere haben,
dann liegt das Ganze als Paraform-Aldient vor.
Das ist so einmal ganz kurz der Abruss zum Thema Quervernetzung
und Form Aluit. Wichtig ist noch,
dass das Ganze optisch ist und sie werden damit arbeiten,
immer schön vorsichtig sind
Der letzte Punkt, oder vielmehr der vorletzte Punkt,
das Antigenmaskieren auf der letzten Folie, hat ja beschrieben,
dass wir durch die Quervernetzung unter Umständen die Antigenerreichbarkeit in einer Färbung schlechter haben.
Und es gibt hier eine ganz schöne Abbildung aus einer Publikation,
die im Prinzip zeigt,
wie sich das Verhalten des Antikörpers in Forbalin über die Zeit verändert.
Sie sehen hier EER, das ist der Estrogenrezeptor,
das ist ein nuklearer Rezeptor,
den sie hier in Braun am Zellkern ganz gut identifizieren können.
Und hier sehen sie, dass über einen gesamten Zeitraum von
30 Tagen insgesamt, ist nichts zu einer großartigen Veränderung kommt.
Also das heißt, der Rezeptor wird von Anfang bis zum Ende relativ gut erkannt.
Das heißt, trotz Formulinfixierung passiert hier nichts das Gleiche.
CK ist ein Südokeratin. Auch hier sieht man kaum einen Unterschied.
Herr 2 ist ein EGF-Rezeptor und mit 1 ist ein,
ebenfalls ein kernständiger Poliferationsmarker, Mikrotopolie.
Entschuldigung, Made in Borskel heißt das hier,
das ist einfach der Klon, der Name.
Ki67 ist der andere Name hier fürs Proliferationsmarker.
Und auch diese beiden sind weitestgehend unabhängig von der Formalinfixierung.
Das heißt also, wir können die ganzen problemlos verwenden oder
diese Antikörper verwenden, auch auf Formelinen fixiertem Gewebe.
Aber, und jetzt kommt das große A,
aber auf der nächsten Folie
Am Beispiel des Vimentee, das ist auch ein Zytoskelettaler Bestandteil,
kann man sehr schön sehen, was für Probleme Formalien machen kann.
Und das sieht man hier. Hier ist eine Mund-Schleimhautzelle Formalien fixiert,
hier im Blau der Kern, dann mit dem Antikörper,
wir werden hingefärbt und sie sehen, dass sie ihn nicht sehen.
Das heißt, der Antikörper bindet nicht.
Und die gleiche Zelle, also auch eine Mundschleimhautzelle,
hier wieder mit dem Blauen der Kern, ohne Formalienfixierung.
Und sie sehen fantastisch diese, ja, schon auch Zytoskelettalen,
Anteile des Vimenteeams, des Epitope auf dem Vimentee,
für den Antikörper, ist erreichbar.
Und sie kriegen eine gute Bindung zustande. Das heißt,
merken sich immer, Fixierung ist ein Problem,
aber ums Fixieren kommt man nicht drum rum,
aber es gibt ja neben der Möglichkeit der Formulinfixierung
auch immer noch
eine andere Möglichkeit
Und das ist die Kryo-Konservierung. Die Kryo-Konservierung basiert im Prinzip darauf,
dass sie eine Abkühlung ihrer Probe auf unterhalb 150 Grad erreichen.
Das ist dann eine sogenannte Kryogene-Temperatur. Hierbei findet eine weitestgehende Einstellung
der aller biologischen Funktionen an. Es kommt zur Eisbildung im
Inneren der Zelle und das ist so ein bisschen das Problem hierbei,
weil es dadurch beim Auftauen zur Kritallbildung kommen kann und diese
wiederum sorgen für Frostschäden in Form von, ja,
einfach destruktiven Ereignissen durch die Scharfkantigen.
Kristalle an Zellorganellen oder auch an Membranstrukturen.
Womit wird Kryo konserviert? Das ist flüssiger Stickstoff im Regelfall.
Er ist mit Vorsicht zu genießen, das ist gefährlich,
weil flüssiger Stickstoff tatsächlich zum einen wahnsinnig kalt ist, minus 196 gehört. Das heißt,
sie können sich dort schlimmste Verletzungen zuführen und zum anderen ist es so,
dass Gas, der Stickstoff, ist im Flüssigenzustand so stark komprimiert,
dass sie im Prinzip auf ein Liter Rs,
700 Liter Flüssigkeit, 700 Liter Gas haben.
Das heißt, wenn sie im kleinen Raum stehen und ihnen fällt,
oder sie verschütten Liter Flüssigkeit,
haben sie auf einmal 700 Liter Gas im Raum und das
kann tatsächlich zum Problem sein.
Ansonsten ist die Kryo-Konservierung eine
sehr gute Alternative zur Konservierung mit Form
Wie findet das Ganze statt? Das machen wir jetzt einmal im Schnelldurchgang,
weil wir das auf einer anderen Folie und auch in einem Video später nochmal sehen,
aber dass sie es hier an der Stelle schon mal zumindest grob gesehen haben,
sie präparieren ihr Organ, ihr Tier hier in dem Fall,
einen inguinalen Lymphknoten aus der Maus,
der hier unten in einem Fettpad liegt,
den präparieren sie frei.
Das ist dieser Lymphknoten-Inguinal. Bei der Maus? Sie beschriften das natürlich alles,
packen den Lymphknoten dann in kleine Emmendorfgefäße,
dokumentieren den Namen der Maus, also sprich eine Nummer,
eine individuelle Nummer für das Tier, dann die Art des Lymphknotens,
inguinal, publitär etc. pp.
, ist das ganze rechts oder links und dann
kommt das in Emmendorfgefäße und wird in Flüssigem
Stickstoff weggefroren