Herzlich willkommen in diesem Teil erzähle ich Ihnen und kürze
die Basics und theoretischen Grundlagen zum Thema Westernblott.
Auf dieser Seite sehen Sie ein Flussschema, eine grobe Übersicht über das,
was man Westernblott macht und wie man davor geht zuallererst,
ist natürlich die Wahl der Probe, das Gesebe oder das Organ von Bedeutung.
Dann wird das Protein aufgereinigt,
sprich aus dem Gewebeverbund oder dem Organ verwohnt werden,
die Zellen aufgebrochen, um an das Protein ranzukommen.
Dieses Lysat wird dann elektrophooretisch in einer elektrophoorise Kammer aufgetragen,
danach wird es gehen, beblottet auf einem Membran.
Diese Membran wird mit Antikörpern gefärbt,
die Antikörper sind dann dementsprechend spezifisch gegen die Epitopo oder die Proteine,
die man gerne sich anschauen möchte und
danach wird das Ganze visualisiert
Der erste Schritt, bis der Proteinaufreinigung. Hierzu muss man im Vorfeld einmal
die Wellen aufschließen, man nimmt das Ganze auch Homogenisierung.
Hier werden die Zellen zerstört, um an deren Inhalt zu kommen.
Das sind in erster Linie Ordanelle, Proteine,
DNA-MRNA oder auch andere RNAs, eben oder andere Bio-Moleküle.
Für uns ist aber das Protein von Bedeutung, das wollen wir uns anschauen,
hier auf der rechten Seite sehen Sie einen Sonyfire,
das ist eines der klassischen Geräte, eine klassische Technologie,
wo mithilfe von Ultraschall-Gewebeverbände aufgebrochen werden, Zellen aufgebrochen werden,
um an deren Inhalte zu kommen.
Ein weiteres Verfahren zur physikalischen Gewebehomogenisierung
ist der Beatbugger
Hierbei kommen unterschiedliche Partikel, Kugeln oder auch anders, andere geometrische Formen zum Einsatz,
die durch heftiges Schütteln das Gewebe desoziieren bzw. fragmentieren und vereinzeln.
Hier in dem Fall haben wir Eisenplättchen einer definierten Größe,
die durch heftiges Schütteln hier in dem Arm von diesem Beatbugger dazu führen,
das, was wir oben drüber befindliche Gewebe im klein gehäckselt wird und des Resultates am Ende dann eine gleichmäßige homogene Proteinmischung.
Das Problem oder der Nachteil dieser Methode liegt darin,
dass durch die Reibung der Kügelchen auch untereinander Wärme entsteht oder sogar Hitze.
Und das ist nicht unbedingt für jedes Biomolekül geeignet beispielsweise.
RNA würde sich hiermit ganz schlecht aufreinigen lassen,
weil die bei höheren Temperaturen kaputt geht und nicht mehr gut messbar ist,
auch einige Proteine leiden unter erhöhter Temperatur. Außerdem ist es so,
dass wenn man Proteine isolieren möchte, dass man schauen sollte,
dass möglichst wenig Protheasen vor Ort sind, die das Protein anknabbern.
Und diese Protheasen wiederum mögen es besonders gerne warm. Das heißt,
generell gilt, also einmal,
dass diese Methode wirklich nur ausgewählt zu benutzen ist,
aber generell gilt halt auch,
dass man all diese Aufreinigungsmethoden lieber bei niedrigen Temperaturen macht auf Eis,
mit gekühlten Puffern,
gekühlten Geräten,
gekühlten Werkzeugen und sich möglichst auch beeilt und nicht
allzu lange rumtrödelt
Die Methode, die wir verwenden,
weil sie convenient ist, weil sie relativ schnell funktioniert,
weil sie keine großen Temperaturen produziert,
die nachteilig sind und die einfach sich auch für unsere Gewebetypen,
den Lymphknoten und den Tymbus als gut geeignet gezeigt haben,
ist das sogenannte Schredder-System oder Kia-Schredder-System.
Hier behandelt es sich im Prinzip um ein Inlay,
ein Einsatz für ein normales Eppendorf-Gefäß.
Dieser Einsatz hat hier in dem Konus ein Sieb,
ein Mesh, was relativ dicht ist.
Hier oben wird das Proteinen gemischt, beziehungsweise das Gewebe reingedrückt und eingelagert.
Dann wird das ganze Zentrifungiert und durch die Zentrifugalkraft wird dieses Gewebe durch dieses Mesh durchgedrückt,
dabei vereinfelt und kommt am Ende dann als homogene Art raus.
Das sehen Sie dann später in dem Video relativ gut,
wie das vonstatten geht.
Das ist einfach eine gute Methode,
die man
generell verwenden kann
Das homogenisierte Gewebe wollen wir nun anschließend, gehen elektrophoretisch auf drin.
Dafür verwenden wir unsere Elektrophoriesekammer. Ganz kurz,
einen entscheidenden Satz für die Erklärung, was ist eigentlich Elektrophoriese,
und zwar ist die Elektrophoriese, die Wanderung elektrisch geladener Teilchen,
durch einen als Trägermaterial dienenden Stoff in einem elektrischen Feld.
Und für uns ist natürlich das elektrisch geladene Teilchen,
was sich dort bewegt, unser Protein, unser Trägermaterial,
das Gel und unser elektrisches Feld,
die Gelkammer beziehungsweise das Gel eingespannt in der Gelkammer
Welche Art von Gel verwenden wir? Es ist ein sogenanntes SDS-Gel.
SDS steht für NATO und dritte Kühlsohlfahrt oder eben Zodium-Dotical Soulfahrt.
Und die Page, oder der Interpret steht im Prinzip für Polyacryl Amid Gel.
Das kann man sich merken. Das sollte man sich
auch merken. Das ist ganz wichtig. Das heißt,
die SDS-Page ist im Prinzip die NATO und so die Kühlsohlfahrt,
wo die Aktien, die Elektropolese.
Ist der S selber? Ist ein Anjoganisches Tensit?
Das haben wir kennengelernt. Das ist eine Detailgenz,
was es auch im Reinigungsbereich ist
Und auch Zahnpasta gibt. Es hat hier für uns oder für den Westernblock,
für die Aufwandigung, für die Auftrille, die Bedeutung,
es knackt nicht kompalente Bindung in Proteinen und dadurch werden Quartier- und Herzellstrukturen aufgelöst.
Das SDS überdeckt zusätzlich noch, das ist eine andere,
mindestens genauso wichtige Eigenschaft,
die Einladung des Proteins und zwar wird es denaturierte Proteine konstant negativ geladen,
dadurch stößt es sich mit anderen Proteinen in der Mischung ab,
also es kommt nicht zur Verklumpung und es kann über den Gehlauf konsistent eine Auftrennung,
über die Kettenlänge stattfinden,
diese Kettenlänge wiederum ist proportional zur Molekülmasse und am Ende heißt das,
längere und größere Proteine sind oben umgeht,
kürzere,
leichtere Proteine werden schneller durch Gehe geleitet und kommen schneller unten
Das Ganze sieht dann hier so aus,
wir haben im Prinzip ein Gehlbeladendes oben in die Kammern,
hier wird der Negative wohl angelanglossen.
Auf der gegenüberliegenden Seite wird der Pluspol angeschlossen,
wie wir gerade auf der Seite davor gesehen haben,
das SDS sorgt dafür, dass die Proteine gleichmäßig negativ geladen sind.
Das heißt, sie stoßen sich vom Minuspol
hier oben ab und wandern zum Pluspol.
Und werden anhand der Größe bzw. der Kettenlänge aufgetrennt.
Hier oben finden sich schwere, langkettige Proteine und hier
unten weniger schwere,
kurzkettige Proteine
Nachdem, das Gehen fertig gelaufen ist,
die Gehen elektrophoriese abgeschlossen und die Proteine aufgetrennt sind,
müssen wir schauen, dass wir diese Proteine transferieren,
und zwar von dem Gel aus dem Polyapola-Mitgeel, auf einem Membran.
Dieser Vorgaben zeichnet das Blotting und wir haben mehrere Möglichkeiten,
wir verwenden Nylon oder PVDF Membran.
Hier haften die Proteine aufgrund Hydrophober oder eben Polara-Wechselwirkung.
Alternativ gibt es Nitro-Zellulose oder Glasfaser, Membran,
wo ionische und Polarewechselwirkung zur Bindung beitragen.
Das Muster der elektrophooretischen Auftrennung vorher aus der Geh-Elektrophorie,
das bleibt im Prinzip eins zu eins erhalten,
das ist wirklich so wie eine Übertragung von einem Medium ins andere,
aber das Gehen bleibt das Gleiche.
Teilweise können allerdings die Proteine naturieren und dadurch wieder sekundär oder
sogar Terzieherstrukturen zurückgewinnen
Das Blotten allgemein kommt aus dem Englischen und bedeutet Fleck oder eben Blotting Paper ist das Löschpapier,
so könnten sie sich das vorstellen,
wenn sie mit Hinter auf einem weißen Papier schreiben und dann schnell mit einem Löschpapier darüber streichen, wenn sie auch quasi das Spiegelbild beziehungsweise den Abdruck des Geschriebenen auf dem Löffpapier sehen. Daher kommt das Blotting,
der Edwin Sazan hat 1975 diese Technologie als erster beschrieben und ausgearbeitet,
neben dem Blotting von Proteinen gibt es noch eine ganze andere,
ganze Menge anderer Technologien, das ist einmal die Auftrennung von DNA-Fragmenten,
das ist der Sazan-Blot,
also die Rekrutisierung beziehungsweise das Blotten des Hazan-Blots,
dann gibt es die Auftrennung von RNA-Fragmenten und das Blotting,
das ist dann das Norzan-Blot des Mestern-Blots,
haben wir beschrieben, Protein- und Protein-Interaktion wäre der FAWS-Summblot,
DNA-Protein-Interaktion des Hauses-Summblot und er erinnert für die Intention,
den Nordwestern, so die letzten drei sind Begriffe,
die man eigentlich nicht wirklich verwendet, das ist so ein bisschen,
naja, also das hat sich eigentlich nie wirklich durchgesetzt,
den Sazan,
Norzan und The Western-Blot,
den werden sie aber
immer wieder treffen
So, jetzt kommen wir auf die letzten Seiten.
Hier geht es ins Protokoll, hier würde ich sie tatsächlich bitten,
dass sie sich einmal bevor sie sich das Video zum Western-Blot gleich anschauen.
Einmal das Protokoll durchlesen und aufmerksam angucken, was da eigentlich getan wird.
Es gibt einige Schritte an Zwischenschritte, die recht interessant und wichtig sind.
Und deswegen wollen wir hier nicht weiter darauf eingehen,
nur einmal in aller Kürze.
Wir arbeiten mit einem Turbo-Blot oder Turbo-Transfersystem beim Blotten.
Das ist dann doch relativ neue Technologie.
Und hier können sie sich, wie gesagt,
einmal das Protokoll dazu angucken und ansonsten viel Spaß beim Video