Liebe Studierenden,
es geht weiter mit der Immunis durch Chemie,
auf den folgenden Folien wollen wir ein bisschen die Basics über diese Färbetechnologie besprechen,
im Anschluss hier dran findet wieder ein,
gibt es ja ein Video,
wie wir üblicherweise im Labor die Immunhistochemie machen und in der Kombination hoffen wir,
dass wir trotz Digitalisierung ihnen ein einigermaßen guten Überblick machen können
oder geben können,
was da eigentlich stattfindet
Die erste Frage ist natürlich, was ist eigentlich Immunhistorischemie,
schnell beantwortet? Es ist die Methode,
mit der man Proteine mithilfe von Antikörpern sichtbar macht oder färbt.
Warum tut man das oder was guckt man sich damit an?
Das ist in allererster Linie die Gewebetypisierung,
sprich um welches Gewebe handelt es sich, die Gewebesublokalisation,
um welche Struktur in einem Gewebe oder in einem Organ handelt es sich,
die telluläre oder subzeluläre Lokalisation.
Also sprich, in welcher Zelle, in welchem Gewebe,
in welchem Organ, ist man Protein aufzufinden oder eben auch nicht.
Und natürlich die subzeluläre Lokalisation ist das Ganze an der Zähne im Braun,
im Zellkern, im Zito Plasma oder das Wasser eigentlich auch schon, genau.
Üblicherweise verwendet man Hochaffine und spezifische Antikörper,
die ein Epitop oder auch mehrere Epitope eines Proteins identifizieren.
Und diese Identifikation oder diese Verbindung ist dann die Antigen-Antikörperreaktion,
die dann stattfindet. Danach braucht man üblicherweise ein Detektionssystem,
ein Florokom oder auch ein Enzym oder andere Konjogate, kommen wir später darauf zu sprechen.
Und wenn Sie wissen wollen, was wir eigentlich untersuchen,
dann ist das die Frage nach der Probe.
Und hier ist es in erster Linie,
sind es Gewebeschnitte oder eben Zellen aus Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Punktharte.
Wenn wir einen Ausblick oder einen kurzen Ausflug in die Medizin machen,
dann wird man dort die Paddo-Histologie oder die Pathologie finden,
sprich, das ist die medizinische Histologie, die sich damit beschäftigt,
in welchem pathologischen Kontext lässt sich ein Gewebe oder ein Organ
oder eben auch eine Zelle oder Zellen aus bestimmten Proben analysieren
Welche Färbung gibt es? Es ist einmal die Immunhistologische Färbung,
sprich die Antikörper vermittelte Färbung von histologischem Gewebe,
also über histischem Proben, sprich Gewebe.
Die Immunfärbung mit psychologischen Präparaten, also sprich einzelnen Fällen
beispielsweise aus dem Sprutum oder Blut oder von irgendwelchen Abstrichen.
Und das Ganze gibt es auch einmal ohne den Antikörper,
also ohne die Antikörper vermittelte Färbung als histologische oder eben sydrologische Färbung.
Da wollen wir aber auf einer anderen Folie,
beziehungsweise in einem anderen Vortrag
drauf zu sprechen wollen
Was muss ich wissen, um mit einem Antikörper zu färben,
ist natürlich, wie sieht eigentlich ein Antikörper aus?
Ich gehe davon aus, dass sie in den meisten Fällen
einen groben Überblick über einen Antikörper haben. Wir gehen das hier einfach nochmal durch,
weil Basiswissen ist sie in totalen grundsätzlichen Immunglobulinen,
also in diesem Fall eine EGG, in zwei Einheiten,
und zwar ist es das Farbfragment und das FC-Fragment,
mit einem Teil des Farbfragments und dem FC-Fragment,
können sie die konstante Region beschreiben.
Das ist der Bereich eines Antikörpers, wie der Name
schon sagt, konstant ist und sich nicht verändert.
Demgegenüber steht die variable Region und an dieser Variablenregion bindet der Antikörper
an ein Epitop und das Antigen, das was er detektieren möchte.
Ansonsten strukturell aufgebaut ist der Antikörper aus einer Heavychain und einer Lightchain.
Diese sind üblicherweise über die Sophie-Prügung miteinander verbunden.
Schauen Sie sich das bitte an, das ist,
wie gesagt, Basiswissen,
was man kennen sollte
Antikörper finden üblicherweise oder finden Sie üblicherweise oder wir im Immunsystem mit Ihren natürlichen Aufgaben,
sprich die Detektion oder auch Optionierung, Optionierung von Strukturen,
um in einer Immunantwort aktiv zu sein.
Uns interessiert jetzt hier in diesem Teil des Kurses erstmal,
aber die Aufgabe des Antikörpers als Werkzeug, als Laborwerkzeug,
warum und genau was machen wir damit eigentlich im Bereich der Biomethoden,
deswegen gehen wir diesen Pfad und dazu kann man gleich von Anfang an sagen,
Antikörper gibt es in zwei verschiedenen Varianten,
das ist einmal der polyklonale Antikörper und der monochlonale Antikörper und
jetzt gucken wir uns an,
was die unterscheidet
Der polyklonale Antikörper ist eine Mischung aus verschiedenen,
gegen diverse Epitope desgleichen Proteins gerichteten Antikörpern. Das bedeutet,
wir detektieren zwar ein und das gleiche Protein mit diesem Antikörper,
aber es gibt unterschiedliche Antikörper,
die eben unterschiedliche Epigruppe auf diesen Protein delektieren.
Das ist ganz wichtig zu wissen und das unterscheidet zu
monoklonalen Antikörpern
Die Herstellung. Hier gilt, die ersten Schritte sind
auch später beim Monoplonalen Attikörper identisch. Sie müssen erst mal
schauen, welches Antigen, welches Protein möchte ich detektieren.
Also unser Target, das wollen wir definieren. Dann wird das Protein,
also das Target isoliert oder ein Preptit daraus,
in Vitrosynthetisiert oder man geht gleich hin und stellt das ganze Protein rekombinant her.
Danach wird dieses rekrumbinante Protein oder ein Vitrosynthetisierte Peptit in einer Mehrfachimmunisierung
in ein Wirtstier injiziert. Und das Immunsystem dieses Wirtstiers erkennt dann,
also das verabreichte Protein und bildet natürlich Antikörper dagegen.
In der Regel finden wir bei polyklonalen Antikörper als Wirtstiere,
Ratte und Kaninchen selten, aber durchaus relevant auch ziegescharf und fährt und weitere.
Nach der Immunisierung wartet man in ein paar Wochen und kann dann polyklonales Antiserium entnehmen.
Und das Aufreinigung, aufreinigen und hat dann den polyklonalen Antikörper.
Der Nachteil eines polyklonalen Antikörpers ist tatsächlich, dass die Kreuzreaktivität
zu anderen Epitopen etwas höher ist als bei monoklonalen Antikörpern.
Das können Sie sich ganz einfach vorstellen. Das liegt daran,
Sie haben ein Protein mit, ich sag mal,
x Epitopen und Sie haben von diesen X-Epitopen einen gewissen Anteil der Antikörper in ihrem polyklonalen Gemisch,
was hochspezifisch ist, Y-Anteile, weniger spezifisch und Fettanteile,
noch weniger spezifisch.
Und diese weniger spezifischen Antikörper, die zwar das gleiche Protein
identifizieren, aber eben an diversen Epitopen.
Die haben natürlich ebenfalls Bindeeigenschaften auch an anderen Proteinen,
wo ähnliche Epitope sind und dadurch kann es im Prinzip
zu sowas wie an der Kreuzreaktivität kommen
Im Gegenüber steht der monoklonale Antikörper und hier ganz,
ganz wichtig, der große Unterschied,
es handelt sich um den Antikörper oder einen Antikörper,
der ein einziges Evitop eines Proteins erkennt.
Also wirklich nur eine Sequenz eines Proteins. Die Herstellung,
und das ist hier auch noch mal besonders wichtig und da würde ich Sie bitten,
dass Sie sich das extra noch mal anschauen auch,
die Herstellung des monoklonalen Antikörpers findet mittels der Hybridom-Technologie statt.
Die ersten drei Schritte sind wie beim Polyknoir Antikörper,
also sprich Identifizierung und Herstellung
rekombinanter Targetproteine
Und dann ist es so, es wird ebenfalls wieder dem Tier appliziert.
Und jetzt ist es so, und das kennen sie,
aus der Vorlesung, um die Immunologie.
Die Immunantwort zieht halt unmittelbar nach sich,
also die Bildung der Antikörper, dass eben auch Plasmazellen,
aus dem B-Zellen-Plasmazellen, differenzieren und diese Plasmazellen dann die Antikörper produzieren.
Und ganz wichtig zu wissen ist, dass die Plasmazellen aus
dem Ort des Geschehens, also aus dem Lymphknoten,
dann auswandern und sich in der Milz anreichern.
Und zwar Wir wissen, jeder,
jede B-Zelle beziehungsweise jede Plasmazelle produziert nur einen Typ von Antikörpern.
Also eine einzige Art Antikörper pro Plasmazelle. Und
diese Plasmazelle wandert dann in die, in die Mails.
Und bei der Hybridom-Technologie geht man dann hin und fusioniert Zellen aus der Mails,
beziehungsweise die Plasmazellen, die man aus der Mails gewonnen hat,
mit einer Myolom-Zelllinie, ist eine Krebszelllinie, die potenziell umsterblich ist und sich permanent teilt.
Und ja, im Prinzip nicht determiniert ist in ihrem Lebenszyklus.
Und die Fusion der Plasmazelle mit der Myolom-Zelle sorgt dann für eine Hybridom-Zelllinie.
Und diese Hybridom-Zelllinie vereinigt dann die Eigenschaften zum einen des B-Infozyten,
beziehungsweise der Plasmazelle, einen bestimmten Antikörper zu produzieren und die Fähigkeit zu unbegrenzten Wachstums.
Im Reagenzglas steht jetzt hier oder eben einfach in Zellkultur.
Für die Gewinnung des monoplonalen Antikörpers nimmt man dann eine einzige Zelllinie,
die Klonal expandiert wird aus einem ganzen Haufen an Zelllinien und sucht sich die aus,
die am besten den Eigenschaften entspricht, die man haben möchte.
Also sprich, für einen Antikörper, der in der Färbung
eingesetzt werden soll, der einfach die beste Färbung zeigt.
Genau, man kann dann nahezu unbegrenzt aus dieser Zelllinie,
die man immer weiter kultiviert, Zellüberstände abnehmen,
in denen der Antikörper sitioniert wurde, reinigt, die aufkonzentriert die.
Und dann hat man am Ende einen gleichbleibenden, eine gleichbleibende Antikörper-Lösung,
die Antikörper, enthält jetzt ein oder das gleiche Epitop,
identifizieren und finden können.
üblicherweise werden monoklonale Antikörper in Mäusen beziehungsweise in Kan heftet
Der ganze, also die Hybridom-Technologie nochmal einmal hier, vereinfacht bildlich dargestellt.
Applikation des Rekombinanten oder des Tageproteins in das Tier.
Danach Abzug bzw. Isolation aller Antikörper aus dem Plasmazellen mit aller Ablasmazellen,
aus der Nils, Isolation der Myolomzellen, Fusionierung zwischen Antikörper,
bildenden Plasmazellen und Myolomzellen, klonale Expansion dieser Zellinien,
schon außerhalb des Organismus, Identifikation des Besten Targets,
also der Zellinie für unsere Zwecke,
verwerfen des Restes und weitere Expansionen,
der Target-Zellinie mit der besten und intensivsten Antikörperproduktion
Ich finde es immer ganz wichtig,
dass man zu so Technologien oder zu so Wegweisenden Ideen auch
die Gesichter wenigstens mal gesehen hat und die Namen gehört hat,
in dem Fall des Monochlonaren Antikörpers und der Hybridom-Technologie sind es Nils Jane,
George oder Georges Köhler,
Caesar Maltin,
die drei haben 1984 für ihre Arbeiten um die Hybridom-Technologie und
die Entwicklung monuklonale Antikörper,
dann auch den Nobelpreis für Medizin bekommen
Die größte Diversität an Antikörpern finden Sie sicherlich im Bereich Life Science und Biotechnologie oder Lebenswissenschaften.
Hier werden im Prinzip hunderttausende von Antikörpern finden hier Verwendung für Färbemethoden in der Zoologie,
in der Botanik, in der Molekularbiologie, in der Mikrobiologie,
in der Neurowissenschaft gibt es ganz bestimmte,
dann gucken sich die Nefrologen natürlich Marke an,
die beispielsweise die Neurobiologen jetzt nicht so interessieren.
Also es ist ein unglaublich diverses Feld, es gibt ganz,
ganz viele Antikörper, die hier Verwendung finden.
In der Diagnostik, in der medizinischen Diagnostik ist es ebenfalls so,
dass die Pathologen, die Histopathologen häufig Antikörper verwenden.
Einmal generell zur Identifikation von Tumorerkrankungen oder auch Stoffwechselerkrankungen oder Thema Infektion
, Parasiten etc. pp., das ist ganz häufig,
moderne Diagnostikverfahren greifen häufig auch darauf zurück, dass man spezielle Mutationen über einen Antikörper detektieren kann. Das heißt,
es ist ein Antikörper, der nicht gegen den Wildtyp eines Proteins,
sondern gegen eine Variante, eine Mutationsvariante ist, die zum Beispiel europospezifisch ist,
in dem Fall von Berav und der V 600 E-Variante,
ist das Ganze sogar später Therapie relevant, also sprich,
wir haben nicht nur Antikörper für die Diagnostik,
sondern tatsächlich auch in therapeutischen Ansätzen gegen Krebsgene,
gegen Onco-Driving-Gene, können solche Antikörper eingesetzt werden.
Und auch das ist ein grandios, großer Markt,
der weiter wächst und sicherlich in den nächsten Jahren
noch eine ganze Menge an Neuerungen im Bereich der Therapie,
der Tumortherapie mit sich bringt
Wir haben jetzt im Prinzip ausreichend besprochen, was Antikörper sind,
wozu man sie einsetzt, wie sie funktionieren,
etc. pp., wofür wir sie einsetzen wollen.
Wir haben aber einen ganz wesentlichen Punkt noch bisher nicht besprochen.
Das ist die Tatsache, dass ein Antikörper selber natürlich nicht sichtbar ist.
Sprich, wenn sie mit einem Antikörper eine Struktur in
einem Gewebe färben wollen, dann werden sie feststellen,
dass sie den natürlich erstmal nicht sehen.
Daher muss man sich an Detektionsmöglichkeit aussuchen und da gibt es
beispielsweise die Konjugation von Antikörpern mit bestimmten Faktoren,
die dann wiederum in bildgebenden Verfahren
sichtbar gemacht werden können
Kann man konjugieren, was kann man koppeln an einen Antikörper,
das sind drei, im Wesentlichen drei Faktoren, Florophore,
Enzyme und Metalle.
Bei Florophon handelt es sich um Florustierende, Verbindung chemischer Verbindung,
die durch die Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge ein anderes Licht,
einer anderen Wellenlänge imitieren.
Das Detail werden wir hier noch besprechen in der Vorlesung zum
Thema Mikroskopie
An der Stelle hier ist wichtig, dass Sie wissen,
wozu werden Sie eingesetzt oder wo werden Sie eingesetzt,
diese Florophore, das ist die IHC und die IF,
das ist die Immundienst-Chemie und die Momfloreszenz oder eben auch in der Durchflusshydometrie,
beispielsweise der Fax-Analyse des Fax bedeutet, Floreszenz Activated Sensorting.
Die Klassiker, die Sie immer wieder finden werden, sind Fitstritts,
Rodamin, Texas Red, Phyko-Eretrinen mit den jeweiligen Farben.
Es gibt aber auch, und auch das werden Sie,
wenn Sie im Rabor stehen,
immer wieder finden,
Alexa Farbstoffe,
Ja, da gibt es im Prinzip eine riesige Auswahl, auch an unterschiedlichen Farben.
Jetzt hier ist der überwiegende Teil dargestellt in Rot,
aber im Endeffekt gibt es alle Farben des sichtbaren Lichts,
die durch Florophore abgedeckt werden können und die sie dann befähigen,
unterschiedliche, ja, unterschiedliche Signale auch koloriert zu analysieren.
Ein zweites Konjugrat, ein zweiter Typ der Konjugrate sind Enzyme.
Hierbei ist es so, dass dieser Enzyme üblicherweise ihre Aktivität entfalten, wenn man ein Substrat dazu gibt. Hier als Beispiel der Einsatzbereich des Westernblots. Das heißt,
im Großen und Ganzen kennen Sie das vermutlich,
Sie haben ein Gel, dann blotten Sie aus,
also dann wird auf dem Gel Protein aufgetrennt,
dann wird das Protein aufgetrennt,
auf einem Membran transferiert und auf dieser Membran wiederum setzen Sie einen primären Antikörper ein,
dieser Antikörper wiederum,
wird dann von einem zweiten Antikörper detektiert,
der ein Enzym,
beispielsweise eine Peroxidase trägt und dann wird das Ganze mit einem
Substrat versehen und dieses Substrat wird durch das Enzym umgesetzt und
dabei entsteht Luministenz und diese Luministenz können Sie dann in einem bestimmten Fotoapparat in einer bestimmten Dunkelkammer detektieren,
sichtbar machen und da gehen die in Westerblot auswerten
Andere Einsatzgebiete wären zum Beispiel komogene Immunfloruszenz, also sprich ebenfalls
die Detektion von Proteinen oder Epitopen auf einem Gewebeschnitt oder auf einem histologischen Schnitt.
Nur durch der zweite Antikörper ist auch hier mit einem Enzym gekoppelt,
zum Beispiel alkalische Forstfortase. Sie bieten ein Substrat an und
dann kommt es eben nicht zur Floruszenz und auch nicht zur Luminiszenz,
sondern wird beispielsweise ein braunes Substrat, in ein blaues Substrat umgewandelt.
Das fällt dann als Niederschlag vor Ort aus und bleibt verhaftet
mit dem Gewebe und dann haben sie eine grobe Zuordnung,
wo ist denn jetzt eigentlich mein Protein auf Interest.
Die letzten Konjugerate, die wir besprechen wollen, sind Metalle,
die setzt man überwiegend aus dem Grund ein,
weil sie stark elektronendicht sind und das ist eine Voraussetzung,
um sie in der Elektronmikroskopie sichtbar zu machen.
Ehrengesehen ist hier kolloidales Gold,
aber es gibt auch andere Metalle, die man einsetzt,
um in der Ultrastruktur gewisse Substrukturen und Bereiche
sichtbar zu machen
Wir unterscheiden in der Färbung mit einem Antikörper zwei Methoden,
das ist die direkte und die indirekte Methode.
Als erstes besprechen wir hier einmal die direkte Methode.
Im Prinzip ist es relativ simpel und der Name erklärt es von selbst.
Es ist die Bindung eines spezifischen Antikörpers, der direkt gekoppelt ist,
also man sieht das hier, das soll die Darstellung sein,
eben mit einem Enzym oder einem Florochrom und das war's.
Es gibt keine Verstärkung oder keine andere Färbung, sondern dieser Antikörper,
der jetzt spezifisch auf unserem Epitopia unten dargestellt bindet,
der ist direkt gelabelt und genau,
dadurch kann man nach einem einzigen Schritt im Prinzip
schon mit dem Mikroskop feststellen,
ob der Antikörper gebunden hat und an welcher Stelle
er gebunden hat
Der direkten Methode steht die indirekte Färbung gegenüber.
Hier ist es so, dass der primär Antikörper kein Konjugart
trägt und die Verwendung eines zweiten Antikörpers notwendig ist.
Dieser zweite Antikörperwitze könnte ja Antikörper genannt,
das Ganze ist schematisch hier dargestellt. Wir haben den Erstantikörper,
das ist dieser, der bindet an ihr Epitop,
also hier in ihrem Gewebe irgendwo in ihrer Probe.
Er selber trägt kein Konjugart und ein zweiter Antikörper,
der an den konservierten Bereich,
das erste Antikörpers bindet an dieser Stelle,
trägt dann wiederum Konjugarte,
entweder Florecrome oder eben auch Enzyme
Das Ganze gibt es sowohl in der Zwei-Schritt als auch in
der Drei-Schritt-Methode. Sie können also sich im Prinzip vorstellen,
das war der Drei-Schritt-Methode, also das hier dargestellt ist,
die Zwei-Schritt-Methode bei der Drei-Schritt-Methode, würden hier an der Stelle
die Fürokrumme fehlen und dann würde einfach ein dritter Antikörper dazukommen,
der dann wiederum konjugiert ist.
Warum macht man das? In erster Linie gilt es hier
, die Signale zu amplifizieren. Sie können sich vorstellen,
ein direkt gekoppelter erster Antikörper,
der auf einem ganz spärlichen oder vorhandenen Epitop oder Protein bindet,
ist reguliert oder also eingeschränkt, was die Signalstärke angeht,
anhand der Bindekapazitäten, die hier hinten in der konservierten Regierung des Antikörpers machbar ist.
Also wenn sie hier zehn Flurokrume dran kriegen,
dann haben sie einen Epitop und zehn Signale,
das kann unter Umständen schwach sein und sie können das Bild gebend nicht darstellen.
Wenn sie sich aber überlegen,
dass man unter Umständen an der gleichen Stelle hier zehn Antikörper-Bindestellen
findet und diese wiederum haben auch zehn Flurokrume gebunden,
dann haben sie schon eine hundertfache Sembalverstärkung.
Also das ist so ein bisschen der Hintergrund,
warum man das macht, dann gibt es technische Gründe,
weil man unter Umständen mit einem und dem gleichen primär Antikörper unterschiedliche Farben detektieren möchte.
Das heißt, man verwendet unterschiedliche Zweitantikörper auf einen und demgleichen.
Primär Antikörper, dazu ist die indirekte Methode auch die
geeignetere und genau
Jetzt wollen wir ein bisschen auf,
mehr auf die Praxis eingehen, auf den folgenden Seiten,
wenn wir ein bisschen den theoretischen Hintergrund der tatsächlichen Färbung und
der einzelnen Schritte in der Färbung beleuchten.
Sehe ich dich in der Immunhistory Chemesien Spülen und Waschpuffer,
hier finden gerade PBS-Puffer, Phosphat gepufferte Salzpuffer, Verwendung,
die man entweder mit oder ohne Tween ansetzt.
Tween ist ein Tensit,
was die Oberflächenspannung Flüssigkeiten verändert,
dadurch die Waschkraft erhöht
Warum Wäschmann? Im Prinzip aus drei wichtigen Gründen.
Zum einen wollen wir den Antikörper, der nicht gebunden hat,
bei der Färbung von den Schnitten entfernen.
Also sprich, ganz einfach den Antikörper verbünden, runterwaschen.
Fertig. Außerdem ist es so gut,
dass wir durch Reparationsartefakte, Lagerung, Trockenumkühlung etc. pp.
gewisse Hintergrundfärbungen in solchen Schnitten sehen und ausgiebiges Spülen, kann diese Hintergrundsignale reduzieren.
Und der dritte Grund ist tatsächlich das beigefügte Detergenzien, also beispielsweise wie Twin,
aber auch Saponin oder Triton, ebenfalls den Hintergrund reduzieren,
weil sie die Waschkraft erhöhen und gleichzeitig Zämme im Brand permabilisieren können.
Das heißt, das Durchdringen, sowohl von Antikörpern,
aber auch von Waschlösungen und Puffern in das Zählinnere wird dadurch erleichtert.
Ganz wichtig ist, immer auf die Konzentration und die Molarität
zu achten. Hier sind schon kleine Fehler oder kleine Veränderungen,
können dramatische Folgen haben, erhöhte Tween-Konzentration beispielsweise,
kann dann wieder Autoflorus, Zens und Hintergrund,
Signale erhöhen oder auch die Integrität des Gewebes reduzieren.
Gleiches gilt, wenn man den PPS-Puffer selber mit zu viel Puffer
oder zu viel Salz ansetzt, also Phosphat oder Salz ansetzt,
dass die Pufferkapazität singt und sie den PH-Bert verschieben,
was wiederum Einfluss auf die Antikörperbindung haben kann.
Genau, das ist ein ganz, ganz wichtiger Punkt,
dass man da immer gut drauf achtet
Was ist Hintergrundfärbung, haben wir jetzt gerade von gesprochen,
Hintergrund- oder auch Backgroundfärbung genannt, vermindert den Kontrast zu einer spezifischen Färbung.
Das ist das berühmte, was wir auch
immer mal wieder hören werden, Signal to Noise.
Sie haben ein spezifisches Signal und ein unspezifisches Signal.
Und wenn Sie sich vorstellen, dass beide Signale gleich hoch sind,
können Sie nicht unterscheiden, was spezifisch ist und was Unspezifisches.
Das bedeutet, Ihr Ziel muss es immer sein,
die unspezifischen Signale so weit wie möglich zu reduzieren.
Und genau, also in dem Fall Hintergrund oder Background Färbung weitestgehend reduzieren.
Die Ursachen für Hintergrund sind zum einen bei der Färbung zu hoch angewendete Antikörperkonzentrationen.
Ein Antikörper bindet natürlich spezifisch an ihrem Epitop,
wenn sie ihn aber nun hoch genug einsetzen und lange genug auf ihrem Gewebe haben,
wird er irgendwann überall dran binden und dadurch entsteht Hintergrund.
Zum anderen ist es Antikien Diffusion, das heißt,
es gibt Epitope, Antigene, Proteine, Strukturen,
die sind löslich, die bleiben nicht an ihrem Ort,
das heißt, wenn sie ihr Präparat vor sich liegen haben,
gehen damit in eine wässrige Phase, also sprich,
sie nehmen die Antikörpervertrieb nun pubertieren, das da drauf.
Da ist eine wässrige Farbe,
auf einmal löst sich dieses Antigen und verlässt einfach die Zelle.
Ursprünglich ist es in der Zelle drin und durch die Lösung
verlässt es aber die Zelle und verteilt sich auf dem gesamten Schnitt.
Und ihr Antikörper bindet zwar spezifisch,
aber eben nicht mehr an dem Ort,
wo er eigentlich binden sollte, nämlich in der Zelle,
sondern über den gesamten Schnitt verteilt.
Das meint man mit Antigen die Fusion.
Dann gibt es gewisse Vorbereitungssituationen, in denen man,
also die Schnitte anfertigt, das sind dann zum Beispiel
Formalien fixierte Paraffinen, angebettete Schnitte. Und wenn man das
Paraffinen vor der Färbung nicht ordentlich aus dem Schnitt rauskriegt,
sorgt das Paraffin auch für Hintergrund. Das heißt,
immer vorsichtig sein und gut sich an die Protokolle halten,
wenn es um das Endparaffinieren geht, weil das eine große Fehlerquelle ist.
Generell, wie sie die Antikörperkonzentration zu hoch oder zu stark einsetzen können,
können sie natürlich auch die Zeit zu lange expandieren.
Selbst mit einer niedrigen Antikörperkonzentration wird irgendwann ab einer gewissen Zeit
auch ein spezifisch niedrigkonzentrierter Antikörper an unspezifischen Bindestellen binden und dadurch den Hintergrund erhöhen.
Nächster Schritt, wir haben einfach nicht ausreichend gewaschen.
Da brauche ich, glaube ich, nicht viel zu sagen.
Das heißt, ungebundener Antikörper bleibt im Gewebe vorhanden und sorgt für Hintergrundsignalen.
Und last but not least ist tatsächlich die unspezifische Bindung beispielsweise eine Sekundärantikörpers.
Das heißt, der Plurochrom oder Enzym konjugierte zweite Antikörper,
der eigentlich ihren primär Antikörper sichtbar machen soll.
Der bindet auch an Strukturen, die er eigentlich
nicht detektieren soll. Und dadurch erhalten sie auch
eine Hintergrundfärm
Neben der Hintergrundfärbung gibt es ein weiteres Artefakt oder eine weitere Schwierigkeit,
mit der wir in der Immunhüsselchemie immer zu kämpfen haben.
Das ist die sogenannte Autofloros-Zenz. Autofloros-Zenz unterscheidet sich von der Hintergrundfärbung dadurch, dass sie tatsächlich,
sie kann nicht weggewaschen werden. Also es ist keine Situation,
die durch zu viel Antikörper oder zu lange Inkubation entsteht,
sondern hierbei handelt es sich um Strukturen im Gewebe,
die per se Licht emittieren, wenn man sie mit Licht einer anderen Wellenlänge anstrahlt.
Hier als Beispiel auf dieser Folie gezeigt,
sieht man relativ gut, die Intimer von Blutgefäßen,
in dem Fall von einer Arterie und die besteht zum überwiegend Teil
aus Colagen und Kollagen hat die Eigenschaft bei einer ganz bestimmten Wellenlänge,
Licht zu imitieren und zwar überwiegend im grünen Bereich,
aber auch gerne in anderen Bereichen.
Da darf man sich nicht in die Irre leiten lassen
Ansonsten müssen Sie wissen, wenn Sie Immunhistochemie auf Gewebe oder auf Zellen machen,
dass Sie, also was gucken Sie sich an?
Welche Bereiche gucken Sie sich an? Der Begriff Lokalisation,
ganz wichtig. Und zwar gibt es einmal, selbstverständlich,
das Muster der zydoplasmatischen Färbung hier in gelb-grünen Bereich gezeigt,
also sprich alle Färbung, die im Zydoplasma sind,
nuklear, kernassoziiert, also der Kern.
Membran ständig, da reden wir von dem Bereich,
der die Zellmembran abdeckt.
Und dann gibt es natürlich noch so Bereiche wie Perinukle Air,
also direkt neben dem Kern oder eben auch gemischte Färbung.
Sprich, wenn wir über eine Lokalisation sprechen,
reden wir meistens über die Sublokalisation in einer Zelle
Der Kern selber wird häufig gegengefärbt mit Dapi.
Dapi ist eine chemische Verbindung, die sich gerne in den
AT-reichen Regionen der kleinen Furche doppelsträngiger DNA anlagert.
Und wenn man diesen Farbstoff, das Dapi,
mit UV-Licht anregt, wird es im blauen Licht sichtbar.
Das ist so ein Bereich zwischen 350 und 450 Nanometer.
Und im Prinzip spiegelt das die ganz typische blaue Kerngegenfärbung in
der Immunissuychemie wieder. Was sie wissen müssen, ist,
dass da neben der DNA auch RNA bindet.
Allerdings ist da das Emissionsmaximum ein bisschen höher,
liegt bei ungefähr 500. Und was sie auch wissen müssen,
was in einem praktischen Labor einfach wichtig ist oder praktischen Laborpraktikum.
Dadurch, dass es die DNA bindet,
hat es eine toxische und eventuell auch muthergehende Eigenschaft.
Also arbeiten sie immer mit Handschuhen
Ja, und dann können Sie sich jetzt zurücklehnen und
den Film genießen. Es folgt quasi ein Video über die
Immunhistochemie und die Färbung mit Antikörpern