Musik Wie kann man im Labor Proteine reinigen, mithilfe der Gelfiltration?
Hier sind wir eine Gelfiltrationssäule, einfach nur eine Glassäule,
hat eine Länge von einem Liter und Durchmesser von anderthalb Zentimetern
und unten ist ein Auslaufhahn, den ich öffne und schließen kann.
Und hier ist jetzt drin gefüllt, unser Gelfiltrationsharz,
das ist ein synthetisches Polynär, welches über den Vernetzungsgrad sozusagen einstellen kann,
das anwischende Porengröße in diesem Polymär vorliegt.
Und in die Poren können jetzt kleine Putti-Molekül hinein diffundieren,
werden dadurch zurückgehalten und große Protein-Moleküle wandern außen sozusagen an den Polymärküchen vorbei,
können dadurch schneller eliluieren als kleinere Proteine.
Und dadurch werden Proteine bei der Gelfiltration nach Größe getrennt.
Neben der Gefetationsmatrix benötigen wir für unseren Versuch Regenzgläser,
hier sind 50 Stück drin, beschriftet mit einem Stift von
1 bis dem 1. bis 50 Dem Letzten sozusagen.
Da werden unsere Fraktionen dann aufgefangen später. Hier habe ich
das Gefilterationsharz. Das ist im Prinzip ein weißes Pulver.
Seefahrdecks, G75. Wenn ich das präparieren möchte,
dann muss ich das über Nacht quälen lassen in meinen Puffer
oder in Wasser und kann das dann später dort reinfüllen.
Beim Reinführen muss ich darauf achten, dass meine Matrix möglichst homogen,
mein Gehwert möglichst so mogin in der Matrix in der Säule drin ist.
Weil wenn ich Luftblasen habe oder irgendwelche Unebenen halten,
dann funktioniert die Trennung nicht mehr.
Dann habe ich hier meinen Gefilterationspuffer. Das ist ein
relativ niedrig molarer Tristpuffer mit einem PH-Wett von 8,5.
Den Puffer kann ich wählen nach den Gegebenheiten meines Proteins.
Der hat keinen Einfluss auf die Trennung, die ich hier machen möchte.
Und ich kann den entweder bei einer Pumpe über die Säule
laufen lassen oder einfach über den hydrostaatischen Druck sozusagen rauslaufen lassen,
dass das auch was wir heute machen würden.
Hier ist mal eine Proteinprobe. Da sind verschiedene Proteine drin
. Einer davon möchte ich gerne rein
Reinigen heute und wir sehen, das ist sehr blau und
ich dort zwei Farbstoffe zugemischt habe. Einmal ein Farbstoff,
dextranblau, der ist ein bisschen heller von der Farbe her,
der hat ein sehr hohes Molokulargewicht und libyiert sozusagen zuerst durch meine Matrix hindurch und dann Brom 4.0-Blau,
einen sehr dunklen blauen Farbstoff, der ein niedriges Moloklargewicht hat,
der als letztes illuiert.
Und dadurch kann ich die Trennung auch ein bisschen visualisieren und beobachten,
während meine Proteine dort zwischen diesen beiden Farbfrotten sozusagen,
die dort entstehen werden, getrennt werden.
Was ich noch habe, ist ein Fotometer,
damit kann ich die Absorption meiner Fraktion analysieren,
weil meine Protein ja weit von 80 Lanometer absorbieren,
die Aromaten, die im Protein drin sind.
Und dazu brauche ich eine Quarzgewette,
mit der ich dann sozusagen meine Proben hier drin analysieren kann.
Bevor wir unsere Probe jetzt oben auf das Gelbett auftragen können,
müssen wir den Puffer, der hier drüber steht, ablaufen lassen.
Da veröffne ich hier unten den 3G-Gehahn,
lass den Puffer in das Becherklasse hineintropfen und muss darauf achten,
dass das Gelbett oben nicht trocken läuft,
dass sozusagen der Puffer gerade eben noch das Gelbett benetzt und
dann werde ich unten wieder den Hahn schließen
So, ich glaube, oben ist es jetzt erreicht,
dass der Puffer gerade eben das Gilbert sozusagen benetzt.
Und das muss sich ja mal eine Probe dort oben auftragen.
Dazu brauche ich hier so einen kleinen Tritt, dass ich
mich auch hinstellen kann. Brauche eine Pipette. Und jetzt
muss ich im Prinzip meine Probe an der Gefäßinnenwand runterlaufen lassen,
dass sie ganz langsam das Gilbert überschichtet. Ich muss aufpassen,
dass das Gilbert nicht aufwirbeln und darf auch die Pipettenspitze nicht
abfallen lassen, wenn die in das Gilbert reinfällt,
dann ist es auch nicht mehr homogen.
Es ist ganz langsam rauslaufen lassen,
nicht zu viel Sprung
Jetzt habe ich eine Milliter Probe aufgetragen, kann sehr schön
die, glaube ich, Farbe dort oben sehen.
Jetzt lasse ich diesen Milliliter reinlaufen in die Matrix,
drehe also wieder meinen Drei-Wege-Handlungen auf und warte wieder,
bis meine gesamte Probe in das Skillbett sozusagen reingelaufen ist,
bis es oben die obere Karte des Skillbetts erreicht.
Dann schließe ich den Hahn wieder. Man darf,
je nachdem, was man machen möchte, bei einer präparativen Reinigung,
maximal fünf Prozent des Säulenvolumens oben aufgeben als Probe.
Und bei einer analytischen Reinigung maximal ein Prozent des Säulenvolumens aufgeben,
damit man diskrete Trendzonen bekommt und die Reinigung auch gut funktioniert.
Somit ist der Milli da reingelaufen von meiner Probe.
Jetzt überschichte ich mit einem Milliliter Gehfiltrationspuffer
Wenn ich hier in der Flasche drin habe. Genauso wie eben,
lasst es ganz langsam und vorsichtig an der Gefäßinnenwand runterlaufen.
Jetzt möchte ich wieder den Hahn unten und lasse diesen Militer
auch wieder in das Gilbett hineinlaufen.
Man kann schon schön sehen, wie sich hier unten
der Headläuf-Hafstoff absetzt,
von dem dunkelblauen Farbstoff
Was ist das textraenblau? Und oben ist es brumm,
4.0 blau. Der Milliliter ist wieder reingelaufen.
Jetzt verschichte ich nochmal. Mit einem Milliliter Puffer. Wieder
auf der Innenseite der Säule das Ganze langsam runterlaufen lassen.
Ganz vorsichtig. Dass diese Milliter erneut in die Matrix reinlaufen
So, der Militär ist wieder drin. Und jetzt überschichte ich sozusagen Pfuffer,
das Harz komplett, wieder einzeln erstmal ein Milita-Schritten.
Wieder ganz vorsichtig, genauso wie gerade eben auch schon mal gezeigt. So,
und jetzt setze ich zum Schluss ein Vorratswelter dort drauf,
den wir hier sehen, den kann man oben auf die Säule draufstecken.
Jetzt biete ich nochmal ein bisschen Puffer hinterher,
aber dann kann ich gleich den Puffer oben reingießen in
das Gefäß und das vollfüllen und der fast ungefähr 250 Himmelliter
Jetzt habe ich bis zu dieser Verjüngung hier Puffer reingefüllt und
jetzt kann ich den Rest einfach reinkippen von oben.
Auch relativ vorsichtig, nicht zu schnell. Das Vorratsgefäß wird bis oben
hin gefüllt, etwa im Zentimeter unterhalb der Kante sozusagen.
Und jetzt kann ich meine Trennung starten,
ich öffne einfach den 3W-Wegeharny unten und lasse die ersten 30 Milliliter,
die lasse ich, die verwerfe ich sozusagen,
da nehme ich hier so ein kleines Ergänzglas für.
Dass sie auch so eine Grarierung hat,
dass ich sehen kann, wann 30 Milliter erreicht worden sind.
Da ist jetzt eh nur Puffer, da noch keine Proteine,
weil die noch hier oben in meinem oberen Bereich sind.
Das heißt, die ersten, die ersten 30 Milliliter
kann ich verschenken
Wir haben jetzt ungefähr 30 Milliliter aufgefangen in unserem kleinen Zertifugenröhrchen und
ich kenne ich mal hier eine Blatt Papier dahinter halte,
dann sehe ich, dass hier der erste blaue Farbstoff ist,
dass das der extraen blau ist.
Hier ist es jetzt relativ farblos und hier wird es
ein bisschen bläulicher und oben natürlich sehr gut zu sehen,
das Brumphenoblau, wo gerade die Klemme hier ist.
Und jetzt fange ich an, Fraktionen zu sammeln.
Dafür habe ich hier meinen Regenzgläser und ich möchte gerne 3
Milliliter Fraktionen auffangen. Dafür habe ich hier an Regenzglas genommen,
habe mal 3 Milliliter reingefüllt und einen Strich gemacht.
Die sieht man hier mit dem schwarzen Balken.
Und wenn ich das hier reinstelle, dann sehe ich,
dass der schwarze Strich ungefähr auf der Höhe ist von dieser Ebene.
Das heißt, ich lasse mit dieser Ebene jetzt sozusagen meine
Fraktion auffangen. Hier ist die 1, 2,
3 und hier ist dann die 10, hier wird die 11,
die 20 und so weiter und so fort.
Ich fange mit der ersten Fraktion an und lasse es
ins erste Regensglas reintropfen. Wie gesagt,
wenn dann der Flüssigkeitsstand auf dieser ähnliche ist,
dann schiebe ich rüber auf das nächste Reaktionsgefäß
Ich kann jetzt die Fraktion schon mal analysieren,
wenn ich sie aufgefangen habe, am Fotometer.
Das muss ich aber erst mal kalibrieren.
Das mache ich mit meinem Gefiltrationspuffer, fülle in meine Quarzgewette.
Hier ist sozusagen für den Strahlengang die Seiten.
Da fülle ich meinen Puffer rein, einen Milliliter.
Tu das hier in den Krivettenhalter rein. Deckel kann ich
ruhig weglassen und jetzt wird es auf null kalibriert.
Mit dem Puffer kann ich jetzt hier Reinkippen, den brauche ich nicht mehr.
Und jetzt fülle ich dort. Fraktionswechsel nicht vergessen, natürlich.
Meine ersten Fraktionen, eine Dieter Poberein. Wer ist die
Absorption? Da kommt ein Wert, in diesem Fall 0,0455.
Die kann ich jetzt auch schon gerne eintragen an meinem Computer.
Ich bin die ersten Spalte, meine Fraktionsnummer,
dann die Absorption und habe den Wert schon mal dort drin.
Jetzt kann ich die Probe wieder hier rausnehmen, die muss ich nicht verschenken,
sondern kann die mit der Pete Pettenspitze wieder hier rausbekommen.
Wieder zurück in meinem Fraktionsgefäß geben
Und jetzt kommt die zweite Fraktion, wie dein Milit daneben.
Ich kann die gleiche Bipettenspitze benutzen,
die muss ich nicht wechseln, fülle das hier rein.
Willkommen an Absorption von 0,04. Ich biete dir die Probe wieder
raus aus der Kühwerte, meine Fraktion rein.
Ist jetzt auch bei der fünften Fraktion,
dass es so leicht bläulich ist, sieht man vielleicht besser,
wenn ich das Papier drunter halte, hinterhalte.
Könnt ihr sehen. Das ist jetzt das Textrahmenblau,
was sozusagen aus der Matrix heraus eluiert.
Jetzt habe ich schon einen ansteigenden Wert, 0,2,2,2,4.
Jetzt kommen auch die ersten Proteine aus der Säule
sozusagen herausgespült
Unsere Gefilteration ist langsam zu Ende. Wir sehen,
dass der blaue Farbstoff, das Brom 4.0-Blau mit dem
geringen Lukolagewicht langsam in die letzte Fraktion hineintropft.
Das ist Fraktion Nummer 50. Ich stelle den Hahn mal aus,
damit wir die mal analysieren können noch.
Wir sehen auch hier schön die Farbe in den Ergänzglas drin.
Die letzten zehn Gläser ungefähr, Ergänzgläser sind alle relativ farbig,
wenn ich das mal so zeige, von der Rückseite.
Kann man sehr schön sehen. Und jetzt messen wir nochmal
die Absorption dieser Probe
0,14-4 tragen das ein,
unsere Excel-Tabelle und bekommen dann auch unseren, unter Komotogrammen,
die ist einmal aufgetragen auf der unteren Achse, die Fraktion,
also von eins sozusagen bis Fraktion 50 und hier aufgetragen ist die Absorption der Proteine,
bei 280 Nanometern und ich habe jetzt hier gerade eben ein Proteingemischt gereinigt,
was auch zwei Proteinen besteht, einem relativ großen Protein,
wo wir hier vorne sozusagen in den ersten Fraktionen,
Fraktion 4, 5, 6, 7,
8 und 9 unser Protein drin haben und dann hier noch ein kleineres Protein,
was hier in der Mitte so ein Peak gibt und ja,
irgendwas war noch an Verunreinigung drin, wo man hinten sehen kann,
auf jeden Fall hat die Größe die Trennung nach Größe geklappt in diesem Fall bei der Gehfilteration.
Ich lasse es noch ein bisschen weiterlaufen,
dass der Rest Farbstoff rausgelaufen ist sozusagen,
aber ich brauche das hinter zu fraktionieren
Weil diese Modulklagerichtsbereich sowieso keine Proteine mehr zu finden sind.
Damit ist unsere Gehfilteration beendet. Der ganze Vorgang hat ungefähr
so zwei, drei Stunden gedauert, je nachdem,
wie gut die Säule sozusagen die Flüssigkeit durch die Sonne hindurchläuft.
Man muss ein bisschen Geduld mitbringen und ein bisschen Sorgfalt beim Fraktionswechsel
und vor allen Dingen auch beim Auftragen der Probe ganz am Anfang.
Das ist sehr, sehr wichtig, dass man das alles sehr gut hinkriegt.
Aber dann funktioniert die Trennung eigentlich sehr gut,
wie wir hier schön sehen können.
Das heißt für heute,
viel Spaß beim Selbstausprobieren