Musik Wie kam er im Labor Proteiner reinigen, mithilfe der Gelfiltration?
Hier sehen wir eine Gelfiltrationssäule, einfach nur eine Glassäule,
hat eine Länge von einem Mieter und Durchmesser von anderthalb Zentimetern
und ist ein Auslaufhahn, den ich öffnen und schließen kann.
Und hier ist jetzt drin gefüllt, unser Gelfiltrationsharz,
das ist ein synthetisches Polynär, welches über den Vernetzungsgrad sozusagen einstellen kann,
das anwischende Porengröße in diesem Polymär vorliegt.
Und in die Poren können jetzt kleine Putin-Modeküle hinein diffundieren,
werden dadurch zurückgehalten und große Protein-Moleküle wandern außen sozusagen an den Polymerküchen vorbei,
können dadurch schneller eluieren als kleinere Proteine und dadurch werden Proteine
bei der Gelfiltration nach Größe getrennt
Neben der Gefetationsmatrix benötigen wir für unseren Versuch Regenzgläser.
Hier sind 50 Stück drin, beschriftet mit einem Stift von
1 bis dem 1. bis 50, dem letzten sozusagen.
Da werden unsere Fraktionen dann aufgefangen später. Hier habe ich
das Gefilterationsharz. Das ist im Prinzip ein weißes Pulver.
Seefahrdecks G75. Wenn ich das präparieren möchte,
dann muss ich das über Nacht quälen lassen in meinem Puffer
oder in Wasser und kann das dann später dort reinfüllen.
Beim Reinfühl muss ich darauf achten, dass meine Matrix möglichst homogen,
mein Gehwert möglichst so mogin in der Matrix in der Säule drin ist.
Weil wenn ich Luftblasen habe oder irgendwelche Unebenen halten,
dann funktioniert die Trennung nicht mehr.
Dann habe ich hier meinen Gefilterationspuffer. Das ist ein
relativ niedrig molarer Tristpuffer mit einem PH-Wett von 8,5.
Die Puffer kann ich wählen nach den Gegebenheiten meines Proteins.
Der hat keinen Einfluss auf die Trennung, die ich hier machen möchte.
Und ich kann die entweder über eine Pumpe über die Säule
laufen lassen oder einfach über den hydrostatischen Druck sozusagen rauslaufen lassen.
Das ist das auch, was wir heute machen würden.
Hier ist mal eine Proteinprobe. Da sind verschiedene Proteine drin.
Einer davon möchte ich gerne reinigen heute. Und wir sehen,
das ist sehr blau, weil ich dort zwei Farbstoffe zugemischt habe.
Einmal ein Farbstoff, dextranblau. Der ist ein bisschen heller
von der Farbe her. Der hat ein sehr hohes
Molocolagewicht und libuiert sozusagen zuerst durch meine Matrix hindurch.
Und dann Brom 4.0 blau, einen sehr dunklen, blauen Farbstoff,
der ein niedriges Moloklagewicht hat, der als letztes illuiert.
Und dadurch kann ich die Trennung auch ein bisschen visualisieren und beobachten,
während meine Protine dort zwischen diesen beiden Farbstoffen sozusagen,
die dort entstehen werden, getrennt werden.
Was ich noch habe, ist ein Fotometer,
damit kann ich die Absorption meiner Fraktion analysieren,
weil man eine Protein ja weit von 80 Knometer absorbieren,
die Aromaten, die im Protein drin sind.
Und dazu brauche ich eine Klauklagewette, mit der ich in
Protinen drin, die im Protlaran anal missieren kann..
Bevor die probra, die protinen, das deln wedert,
die prot, protin, die in der lauckert,
die in dran de, prot.
Daran d möt, 3 weder m, prot,
die lauckert, das decker lat, de, drat.
Und da d d de d. Das ist das dälöt,
prom, die dä d lau.
Das ist der lauckert, de, das d d d de.
Und da de de d d
So, ich glaube, oben ist es jetzt erreicht,
dass der Puffer gerade eben das Gilbert sozusagen benetzt.
Und das muss sich ja mal eine Probe dort oben auftragen.
Dazu brauche ich hier so einen kleinen Tritt,
dass ich mich auch hinstellen kann.
Ich brauche eine Pipette
Und jetzt muss ich im Prinzip meine Probe an der Gefäßinnenwand
runterlaufen lassen, dass sie ganz langsam das Gilbet überschichtet.
Ich muss aufpassen, dass das Gilbet nicht aufwirbeln.
Und darf auch die Pipatin-Spitze nicht abfallen lassen,
wenn man die in das Gilbett reinfällt,
dann ist es auch nicht mehr homogen
Es ist ganz langsam rauslaufen lassen,
mit nicht zu viel Sprung
Jetzt habe ich eine Milliter Probe aufgetragen. Kann sehr schön
die, glaube ich, Farbe dort oben sehen.
Jetzt lasse ich diese Milliter reinlaufen in die Matrix.
Drehe also wieder meinen Drei-Wege-Handlungen auf und warte wieder,
bis meine gesamte Probe in das Skillbett sozusagen reingelaufen ist,
bis es oben die obere Kanne des Gilbetts erreicht.
Dann schließe ich den Hahn wieder
Man darf, je nachdem, was man machen möchte,
bei einer präparativen Reinigung,
maximal 5 Prozent des Säulenvolumens oben aufgeben als Probe.
Und einer analytischen Reinigung maximal 1 Prozent der Säulenvolumens aufgeben,
damit man diskrete Trendzonen bekommt und die Reinigung auch gut funktioniert.
Somit ist der Militer reingelaufen von meiner Probe.
Jetzt überschichte ich mit einem Militer Gefilterationspuffer. Wenn ich
hier in der Flasche drin habe. Genauso wie eben,
lasst es ganz langsam und vorsichtig an der Gefäßinnenwand runterlaufen.
Amen. Amen. Amen. Amen. Amen. Amen
. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama.
Ama. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama
. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama.
Ama. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama
. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama.
Ama. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama
. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama.
Ama. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama
. Ama. Ama. Ama. Ama. Ama.
Ama. Ama. Ama. Ama. A. Ama.
A. Ama. A. A. A. A. A. A. A. A.
A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A.
A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A
.. Das . A. . A. A. A. . .
. . m... . A. A. A. . . ......................
...... ........ ........ .. ....... .... Ich . .... . .
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. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. Das ist das . .. .... . . . .
. . ....... Der . . .. . ... . .
. . . . . . . . .
...... . . ... . ........................................................................................................................................... ä..... ... .
.. .......................................................................................................................................................................... ... ....
So, der Militer ist wieder drin.
Und jetzt überschichte ich sozusagen Pfuffer, das Harz komplett,
wieder einzeln erstmal ein Militerschritten.
Wieder ganz vorsichtig,
genauso wie gerade eben auch
schon mal gezeigt
So, und jetzt setze ich zum Schluss
ein Vorratswelt da dort drauf, den wir hier sehen.
Die kann man oben auf die Säule draufstecken.
Jetzt biete ich nochmal ein bisschen Puffer hinterher,
aber dann kann ich gleich den Puffer oben reingießen in das Gefäß,
sind das vollfüllen. Und der fast ungefähr 250 Himmelliter.
Jetzt habe ich bis zu der Verjüngung hier Puffer reingefüllt und
jetzt kann ich den Rest einfach reinkippen von oben.
Auch relativ vorsichtig, nicht zu schnell. Das Fest wird bis oben
hin gefüllt, ich war im Zentimeter unterhalb der Kante sozusagen.
Und jetzt kann ich meine Trennung starten,
ich öffne einfach den drei Wege Harny unten und lasse die ersten 30 Milliliter,
die lasse ich, die verwerfe ich sozusagen,
da nehme ich hier so ein kleines Ergänzglas für,
dass sie auch so eine Grariierung hat,
dass ich sehen kann, wann 30 Milliter erreicht worden sind.
Da es jetzt eh nur Puff hatte und noch keine Proteine,
weil die noch hier oben in meinem oberen Bereich sind.
Das heißt, den ersten, die ersten 30 Milliliter
kann ich verschenken
Wir haben jetzt ungefähr 30 Milliliter aufgefangen in unserem kleinen Zertifugenröhrchen und
ich kenne ich mal hier eine Blatt Papier dahinter halte,
dann sehe ich, dass hier der erste blaue Farbstoff ist,
dass das der extraen blau ist.
Hier ist es jetzt relativ farblos und hier wird es
ein bisschen bläulicher und oben natürlich sehr gut zu sehen,
das Brumphenoblau, wo gerade die Klemme hier ist.
Und jetzt fange ich an, Fraktionen zu sammeln.
Dafür habe ich hier meinen Regenzgläser und ich möchte gerne 3
Milliliter Fraktionen auffangen. Dafür habe ich hier an Regenzglas genommen,
habe mal 3 Milliliter reingefüllt und einen Strich gemacht.
Die sieht man hier mit dem schwarzen Balken.
Und wenn ich das hier reinstelle, dann sehe ich,
dass der schwarze Strich ungefähr auf der Höhe ist von dieser Ebene.
Das heißt, ich lasse mit dieser Ebene jetzt sozusagen meine
Fraktion auffangen. Hier ist die 1, 2,
3 und hier ist dann die 10, hier wird die 11,
die 20 und so weiter und so fort.
Ich fange mit der ersten Fraktion an und lasse es
ins erste Regensglas reintropfen. Wie gesagt,
wenn dann der Flüssigkeitsstand auf dieser ähnliche ist,
dann schiebe ich rüber auf das nächste Reaktionsgefäß
Ich kann jetzt die Fraktion schon mal analysieren,
wenn ich sie aufgefangen habe, am Fotometer.
Das muss ich aber erst mal kalibrieren.
Das mache ich mit meinem Gefiltrationspuffer, fülle in meine Quarzgewette.
Hier ist sozusagen für den Strahlengang die Seiten.
Da fülle ich meinen Puffer rein,
einen Milliliter
Tu das hier in den Krivettenhalter rein. Deckel kann ich
ruhig weglassen und jetzt wird es auf null kalibriert.
Den Puffer kann ich jetzt hier reinkippen,
den brauche ich nicht mehr. Und jetzt fülle ich dort.
Fraktionswechsel nicht vergessen, natürlich. In der ersten Fraktion,
eine Dieter Poberein
Mir ist die Absorption. Da kommt ein Wert, in diesem Fall 0,045.
Den kann ich jetzt auch schon gerne eintragen an meinem Computer.
Ich habe in der ersten Spalte meine Fraktionsnummer, dann die Absorption.
Und habe den Wert schon mal dort drin. Jetzt kann ich
die Probe wieder hier rausnehmen. Die muss ich nicht verschenken,
sondern kann die mit der Pikettenspitze wieder hier rausbekommen.
Wieder zurück in meinem Fraktionsgefäß geben. Und jetzt kommt die
zweite Fraktion, wie dein Milit daneben. Ich kann
die gleiche Pipettenspitze benutzen, die muss ich nicht wechseln.
Füll das hier rein. Da kommen wir an Absorptionen von 0,04.
Ich biete dir die Probe wieder raus aus der Kühwerte,
meine Fraktionen rein. Ist jetzt auch bei der fünften Fraktion
, dass es so leicht bläulich ist.
Sieht man vielleicht besser, wenn ich das Papierte runterhalte, hinterhalte.
Könnt ihr sehen. Das ist jetzt das Text Rahmenblau,
was sozusagen aus der Matrix heraus eluierte.
Amen. Amen. Amen. Amen. Amen.
Ich habe schon einen ansteigenden Wert. 0,22224. Jetzt kommen auch
die ersten Proteine aus der Säule
sozusagen herausgespült
Unsere Gehfilteration ist langsam zu Ende. Wir sehen,
dass der blaue Farbstoff das Brom 4.0 blau mit dem
geringen Lukolagewicht langsam in die letzte Fraktion hineintropft.
Das ist Fraktion Nummer 50. Ich stelle den Hahn mal aus,
damit wir die mal analysieren können noch.
Wir sehen auch hier schön die Farbe in den Reagenzglas drin,
die letzten zehn Gläser ungefähr, Regensliser sind alle relativ farbig,
will ich das mal so zeigen, von der Rückseite.
Kann man sehr schön sehen. Und jetzt messen wir nochmal die Absorption dieser Probe. 0,14444 tragen das ein,
unsere Excel-Tabelle und bekommen dann auch unseren Komotogramm,
die ist einmal aufgetragen auf der unteren Achse die Fraktion,
also von eins sozusagen bis Fraktion 50 und hier aufgetragen ist,
die Absorption der Proteine, war jetzt dann 80 Nanometern.
Und ich habe jetzt hier gerade eben ein Proteingemischt gereinigt,
was auch zwei Proteine besteht, einem relativ großen Protein,
wo wir hier vorne sozusagen in den ersten Fraktionen,
Fraktion 4, 5, 6, 7, 8 und 9,
unser Protein drin haben und dann hier noch ein kleineres Protein,
was hier in der Mitte so einen Peak gibt.
Und ja, irgendwas war noch an Verunreinreinigung drin,
wenn man hinten sehen kann. Auf jeden Fall hat die Größe
die Trennung nach Größe geklappt in diesem Fall bei der Gehfilteration.
Ich lasse es noch ein bisschen weiterlaufen,
bis der Rest Farbstoff rausgelaufen ist sozusagen,
aber ich brauche das nicht mehr zu fraktionieren
Weil diese Modulklagerichtsbereich sowieso keine Proteine mehr zu finden sind.
Damit ist unsere Gehfilteration beendet. Der ganze Vorgang hat ungefähr
so zwei, drei Stunden gedauert, je nachdem,
wie gut die Säule sozusagen die Flüssigkeit durch die Sonne hindurchläuft.
Man muss ein bisschen Geduld mitbringen und ein bisschen Sorgfalt beim Fraktionswechsel
und vor allen Dingen auch beim Auftragen der Probe ganz am Anfang.
Das ist sehr, sehr wichtig, dass man das alles sehr gut hinkriegt.
Aber dann funktioniert die Trennung eigentlich sehr gut,
wie wir hier schön sehen können.
Das heißt für heute,
viel Spaß beim Selbstausprobieren