Musik Wie wird eine Judenaustauschkommotografie im Labor durchgeführt zur Proteinreinigung?
Das Wichtigste ist unser Zellextrakt. Da ist unser Protein drin,
das wir gerne reinigen wollen. In diesem Fall kommt der aus Ecoli-Bakterien.
Wir haben die Bakterien aufgeschlossen und alle löst sich in Zellbestandteile
, sind jetzt hier drin in diesem Zellextrakt.
Also neben ganz vielen Proteinen, auch Metapoliten, Kohlenhydrate,
andere Zellbestandteile, die löstlich sind. Und einprotein davon,
wenn wir reinigen, und zwar über einen Anion-Austtauscher.
Den Anion-Austtauscher sehen wir hier. Das ist diese kleine
weiße Säule
Ein Volumen von fünf Miglietern. Und an den Austauscher heißt,
dass sie in diesem Fall positiv geladene Gruppen trägt.
Meistens sind das Amino-Gruppen und an denen können negativ geladen,
also anjonische Proteine dran binden.
Und diese Matrix wird auch als stationäre Phase bezeichnet oder als Säule.
Und das ist so der Begriff dafür im Labor.
Wir haben hier zwei Puffer, einmal ein Puffer A,
einmal ein Puffer B. Dieser Puffer arbeitet auch als Startpuffer bezeichnet,
der Puffer B als Eduktionspuffer.
Puffer A besteht aus 30 Millimulator Tris.
Die Puffersubstanz in der Biochemie mit einem Pervett von
Und der PH-Bett ist so eingestellt, dass unser Protein,
was wir reinigen wollen, bei diesem PH-Wert negativ geladen.
Vorliegt, also Arjunsch vorliegt. Das heißt, ich muss
einen PH-Wert wählen, der über dem esektrischen Punkt liegt.
Und damit wird die Säule equilibriert, auf den Richtung PH-Wert
eingestellt, damit die Bindungsbedingungen optimal sind unseres Proteins.
Die Bindung erfolgt über elektrostatische Wechselwirkung, das heißt,
unser negativ geladenes Protein, bin in ein positiv geladene Gruppen.
Dann kann ich alles, was nicht bindet,
auswaschen mit unserem Start-Puffer A und dann zum Herausfasch unseres Proteins später,
nämlich diesem Puffer B,
der Elutionspuffer
Ist identisch mit Puffer A,
nur das ist in diesem Fall Ein-Mola Natrinklorit mit enthalten sind.
Und das Salz, das Natrinklorit, sorgt dafür,
dass unser Protein dann über Konkurrenzreaktionen mit den NATO- und Klurit-Ionen von
der Matrix gewaschen werden und damit dann illuiert werden kann.
Heutzutage wird die Ionen-Austausch-Motografie mit sogenannten Kommotografiesystemen durchgeführt.
Hier sind wir ein relativ kleines Modell, das vom Hersteller
Ektar bezeichnet wird. Also das ist also die Ektar-Anlage.
Und hier haben wir im Prinzip eine Pumpe,
mit der können die beiden Puffer A und B
angesaugt werden
Darüber haben wir einen Fraktionssammler, der wird mit Regenzgläsern bestückt,
wo wir einzelne Fraktionen auffangen können, von unserer Proteinreinigung.
Da haben wir hier ein Ventil, da kann geschaltet werden,
ob der Puffer über die Säule geht oder halt an der Säule vorbei zum Beispiel,
da drunter unterhalb meiner Säule habe ich eine Messzelle,
mit der wird die Absorption gemessen, der Proteine,
in diesem Fall bei 280 Nanometern und auch die Leitfähigkeit,
also der Johngehalt wird gemessen von dieser Messzelle.
Hier sehen wir unsere Probenschleife, da wird gleich der Zellextrakt eingefüllt,
den ich gerne reinigen möchte und dort hinten sind noch zwei Schläuche,
einmal ein Schlauch mit einem A dran,
einmal im Schlauch mit einem B,
die werden dann gleich in die beiden Puffer,
Startpuff und Elutionspuffer gehängt und damit werden dann unsere Puffer über die Säule transportiert.
Und das Gerät kann jetzt alles kontrollieren, also die Flussrate,
die Flussgeschwindigkeit kann eingestellt werden, das Verhältnis von Puffer A zu Puffer
B kann eingestellt werden,
wie die zusammengemischt werden und auch die Größe der Fraktion,
die hier oben im Fraktionssammler aufgefangen werden, von ein bis,
ja, wie liebiges Volumen sozusagen, kann ich mit dem Gerät programmieren.
Hier ist ein Computer,
mit dem kann ich einmal das Gerät programmieren und genau festlegen,
mit welchen Parametern die Proteinreinigung ablaufen soll und ist auch noch
ein Programm dort drauf,
mit dem ich die Proteinreinigung kontrollieren und analysieren kann
Beginn der Proteinreinigung, muss ich jetzt meine Proteinprobe erstmal auf
den richtigen PH-Wert bringen und mit meinem Startpuffer mischen.
Und dann in diese Probenschleife einfüllen. Und dazu nehme ich jetzt erstmal eine Pi-Petal,
nehme hier ein Milliliter Zellextrakt auf und gebe diesen in den Startpuffer,
den ich hier in Becherglas vorgelegt habe.
Und jetzt habe ich hier eine Spritze,
die hat ein Volumen von zehn Millilitern und Die wird jetzt gefüllt mit meinem,
mit meiner Proteinprobe, die jetzt mit dem Startpuffer vermischt wurde.
Möglichst luftblasenfrei, dass da keine Luftblasen drin sind in der Spritze.
Und jetzt habe ich 10 Milliliter ungefähr, einen Tick mehr hier reingefüllt.
Und jetzt wird die Spritze in die Mitte von diesem Ventil aufgesetzt.
Es wird ein bisschen gedreht, dass die Spritze auch richtig festsitzt.
Und es wird der Kolben reingedrückt und währenddessen wird dann durch
diesen grünen Schlauch die Probe hier eingefüllt und der Stempel wird nach oben gedrückt.
Und dann wird dadurch meine Proteinprobe in diese Probenschleife eingefüllt
Als nächstes müssen die Schläuche in die richtigen Puffer angeschlossen werden.
Die Anlage wurde in 20% Ethanolen gelagert.
Das ist so eine Art Konservieren, damit keine Mikroorganismen wachsen
können und die Sachen Die Puffer von innen vergammeln sozusagen.
Und zuerst muss ich mit Wasser spülen.
Ich habe hier eine Flasche mit destilliertem Wasser.
Um hängen beide Schläuche. In das Wasser hinein.
Und jetzt muss ich bei der Anlage ein Programm wählen.
Das heißt, erst muss ich auf Templates gehen,
dann Application Template. Und jetzt gibt es ein Programm,
das heißt
System Wash Method
Und das muss sich die Puffer anwählen, Puffer und B,
das ist schon voreingestellt, drück auf okay.
Ich muss nochmal mit okay bestätigen. Und jetzt hört man,
wie die Pumpe läuft. Man sieht auch hier hinten,
wie dort jetzt Puffer rausläuft. Und jetzt ist erstmal der
eine Schlauch gespült, und zwar Schlauch B mit Wasser,
mit 50 Millilitern pro Minute.
Und dann wird nach einer gewissen Weile Schlauch A gespült.
Ist wohl die Anlage mit Wasser gespült.
Und jetzt kann ich die Schläuche in die Puffer hängen.
Den Schlauch A hänge ich natürlich im Puffer A rein
Den Schlauch B. Nicht im Puffer B. Und Spielanlage erneut mit diesen beiden Puffern,
also wieder das gleiche Programm, auf Application Template gehen,
auf System Wash Method, die Schläuche A und B auswählen.
Und los geht's. Wir haben jetzt die Probe vorbereitet,
haben die Schläuche angeschlossen bei der Ektaranlage. Jetzt muss noch
der Fraktionssammler vorbereitet werden. Hier gibt es so einen kleinen
Den kann man zur Seite drücken nach rechts und dann rastet er ein.
Und hier ist jetzt im Prinzip so eine Adron-Deal,
wie kann ich einzelne kleine Reagenzleser reinsetzen und habt jetzt ungefähr mit 40 Regenzlesern bestückt.
Hier oben ist so ein kleines Rädchen, über das wird
das Rondil bewegt. Und wenn ich das jetzt einsetzen möchte,
muss ich das ein bisschen zur Seite drücken.
Damit das auch passt und wenn ich es mit der Hand
drehen möchte, auch das Rädchen hinten zur Seite wegdrücken.
Und jetzt wird das so hingedreht,
dass das erste ergänzt, lass sozusagen an der Spitze von
unserem Arm ist
Wenn ich die wieder ransetzen möchte, einfach ein bisschen hochheben und dann arretiert,
geht so eine Arretierung los. Und jetzt noch so hinsetzen,
dass das erste Reagenzglas mittig bei dieser weißen Platte sozusagen vorsitzt.
Und dann haben wir das sozusagen schon mal vorbereitet.
Bevor wir unsere Chrommotografie starten, müssen wir am Computer noch das richtige Programm öffnen.
Das heißt Prime View. Und jetzt kann ich,
also hier sehe ich einmal dargestellt,
auf der unteren Achse die Minuten und auch Mitglieder.
Ich kann sozusagen hier draufklicken und dann wird der Parameter verändert.
Und auf der anderen Achse hier oben kann ich verschiedene andere Parameter
mir anschauen. Davon will ich ganz viele nicht sehen.
Ich kann hier auf Properties klicken und kann die Sachen,
die mich nicht interessieren, wegklicken.
Sind schon aufgeräumter aus. Das Untere brauche ich auch nicht.
Und damit sind wir gleich, wie unsere Putinreinigung erfolgt.
Ich sehe hier einmal die Absorption vom UV-Licht,
was wir hier in Blau sehen.
Ich kann aber auch die Leitfähigkeit mir anschauen,
die Konjunktivität oder die Konzentration an Puffer B,
die zugepumpt wird
In der Regel habe ich das auf Fahrabsorptionen stehen.
Und jetzt kann ich an der Ektar unser Reinigungsprogramm starten.
An der Ektaranlage muss jetzt noch die UV-Lampe einschalten,
die ja unterhalb der Messzelle sitzt und die Absorption misst.
Da wird übrigens auch die Leitfähigkeit gemessen, die wir gleichzeitig aufzeichnen können.
Und dafür muss ich auf Set Parameters gehen und die Lampe anschalten.
Jetzt ist sie angeschaltet. Und das Programm jetzt zu starten,
gehe ich auf Run Stored Method. Und jetzt habe ich
einmal Programme in dem Gerät selbst gespeichert oder auf dem PC.
Jetzt muss ich auf PC gehen,
weil ich dort darauf zugreifen will, auf ein gespeichertes Programm.
In diesem Fall ist das Programm Nummer zwei. Hör auf
, okay. Ich bestätige nochmal das Ganze und dann geht unsere Chrommotografie los.
Jetzt pumpt das Gerät mit fünf Millilitern pro Minute.
Und erstmal pumpt er für fünf Minuten,
damit der PH-Wert in der Säule eingestellt wird.
Auf dem PH wird unsere Startprofess, PH 7,5. Und wir
sehen hier am Monitor, wie jetzt sich die Parameter verändern.
Die Absorption ist vor allen Dingen zu sehen,
die Achsen sind dynamisch, passen sich also immer den jeweiligen Peaks an.
Und einmal sehen wir unten die Minutenanzahl, ich klicke das mal auf Milliliter.
So. Und nach fünf Minuten wird das Ventil umgestellt,
dass dann sozusagen die Probe aufgegeben wird.
Das heißt, dieser Stempel wird dann runtergedrückt.
Die Probe wird auf die Säule gegeben.
Und dann wird auch angefangen im Fraktionssammler die Fraktion zu sammeln
Jetzt hat er angefangen, hier reinzutröpfeln. Ja, das heißt,
in der ersten Fraktion wird jetzt die Probe gesammelt und er hat gleichzeitig,
drückt er jetzt den Stempel hier runter, ja,
man kann das sehen, dass die Probe jetzt runtergedrückt wird,
die wir vorher eingefüllt haben und dann über den grünen Schlauch,
über das Ventil, auf eine Säule transportiert wird.
Und gleichzeitig wird unser Fotometer auf null abgegleicht, damit wir
sozusagen dort den Lehrwert haben des Puffers mit der Absorption.
Amonitor ist auch eine Eins zu sehen für die erste Fraktion,
die er sammelt. Und nach fünf Minuten oder nach fünf
Millililitern, nach einer Minute wird der Fraktionsanwalt weiter transportiert.
Das wird die Probe aufgegeben auf die Matrix und alle Proteine,
die die richtigen Ladung tragen, die also animonisch sind,
können binden und die falsch geladenen Proteine,
die nicht binden können, die werden jetzt rausgespült,
man kann das am Monitor sehen, dass die Absorption steigt,
von null auf, inzwischen schon 250,
es geht mal weiter nach oben.
Das sind jetzt alle Proteine, die nicht minten können,
die rausgewaschen werden. Jetzt fängt ja die nächste Fraktion auf,
wird auch im Monitor angezeigt, dass die Fraktion gewechselt hat.
Und es wird exakt zehn Milliter Probe aufgetragen. Das ist auch wichtig,
dass man die Probenschleife bis zum Maximum vollfüllt,
weil sonst würde das von der Programmierung nicht hinkommen und
der Lauf würde nicht funktionieren
Unsere Probe ist jetzt komplett aufgetragen. Das heißt,
zehn Milliter wurden jetzt hier reingedrückt in die Probenschleife.
Unsere Probe wurde durch den Stempel drauf transportiert.
Und es wird sozusagen direkt Puffer A über die Säule gespült,
damit nochmal die restlichen Proteine, die nicht binden können,
herausgewaschen werden.
Und gleich müsste auch die Absorption,
die blaue Covid nach unten gehen
Die Säule wird mit 10 Milliliter Puffer gewaschen, mit Startpuffer A
und dann haben wir wieder unsere Basislinie erreicht, bei der Obsorption.
Und jetzt fängt er an, langsam immer mehr Puffer B zuzugeben,
man hört das auch klacken, das heißt,
das Ventil schaltet um und der Elotionsprojekt wird zugemischt und es wird ein linearer Gradient gefahren,
von 0 auf 100 Prozent Puffer B, innerhalb von 90 Millilitern.
Man kann das am Komatogramm sehen durch die grüne Linie,
die jetzt langsam unten aufsteigt, das ist die Konzentration pro VB,
wenn ich da mal draufklicke.
Den sehen wir, es geht von 0 bis 100 Prozent
und wir sind hier gerade am Anfang
Man sieht es, dass die Leitfähigkeit steigt.
Wenn ich mal draufklicke, sehe ich hier die Achse.
Wir sind hier an einer Familie, sind es pro Zentimetern.
Bei mehr oder weniger ganz wenig ging es los,
denn es wird immer mehr hofer Beet zugemischt,
also Nazi und Chlorit und deshalb steigt so langsam die Salzkonzentration
an.
Und das wird hier in Rot gemessen
Man sieht jetzt ein leichtes Ansteigen der Absorption. Das heißt,
wir haben jetzt ein Salzgehalt erreicht,
bei dem Proteine illuieren, von der Matrix,
aufgrund der Konkurrenzsituation, mit den NATO-Kloritionen,
reicht die negative Ladung der Einigung nicht mehr aus,
dass sie an die Matrix heften können und werden damit herausgewaschen.
Und das sehen wir mit dem Ansteigen der Absorption.
Und wir können auch genau sehen,
welche Fraktionen das Ganze ist, Fraktion 12,
die jetzt gerade sozusagen aufgefangen wird,
da ist ein Protein drin
Unsere Putin-Reinigung ist fertig und hier sind wir unser Kommotogramm,
nochmal in Blau, die Absorption der Proteine bei 280 Nanometer,
aber dort die Aromaten absorbieren, die wir im Protein drin haben.
Und man sieht jetzt hier im Prinzip bei Punkt 0,
vorher haben wir equilibriert,
haben unseren Startpuffer auf die Sonne gegeben,
damit der PH-Welt eingestellt wird und wir sehen dann hier unseren Probenauftrag,
das ist in diesem Bereich hier drin Wir sehen,
dass dort dann auch eine ganze Menge an Proteinen nicht bindet an die Matrix,
weil die Ladung nicht die richtige ist und damit keine Interaktion,
kein Festhalt an der Matrix stattfindet.
Und dann wird hier, sehen wir in Grün,
einmal die Konzentration Puffer B von 0 bis 100 Prozent,
die wir dann irgendwann erreicht haben, geht hier los.
Und hier sind wir die Leitfähigkeit, die einen Tick später sozusagen registriert wird.
Und man sieht, dass hier so eine ganz,
ganz kleine Delle im Komatogramm zu sehen ist.
Das heißt, das sind Verunreinigungen, die rausgespült wurden,
die auch an die Matrix gebunden haben,
aber relativ geringen Salzkonzentrationen
dann rausgewaschen wurden
Sind wir einen relativ schönen, relativ symmetrischen Peak auch,
der zwischen Fraktion 12 und 16, 17 ungefähr zu sehen ist.
Und da ist also auch ein Protein runtergewaschen worden, rausgewaschen worden. Das Protein,
was wir eigentlich reinigen wollten, was wir von diesem anderen Sachen,
die davor, von der Säule illuierten, getrennt wurden.
Der Gradient geht bis auf 100 Prozent pro Phabé, also Aimulanatemplorit,
dann wird es nochmal dort für gute 10 Milliliter gewaschen,
das wirklich auch stark bindende Verunreinigung herausgewaschen werden können.
Und dann wird wieder auf Null gesetzt, die Leitfähigkeit,
also wird nur noch mit Pufferadam gepumpt,
damit die Salz aus der Anlage wieder rausgewaschen werden,
weil Salzen würden auch die Dichtungen kaputt machen und damit das Gerät möglichst wenig in Mitleidenschaft gezogen wird.
Das ist sozusagen jetzt unsere Putin-Reinigung. Jetzt würde man die Fraktion nehmen,
indem man das Protein vermutet, würde das weiter analysieren können mit einer,
zum Beispiel mit einer Aktivitätstesse, wenn das Enzyme wären,
über die biochemische Aktivität oder über eine SDS-Page,
über eine Pullercruder-Meet-Gelektorese, die Proben auftrennen und dann analysieren,
wie groß sind die Proteine und wie sauber sind sie?
Zum Schluss müssen wir noch die Anlage wieder spülen,
damit die ganzen Salze rauskommen sozusagen aus dem System und zwar erst mal mit Wasser.
Das heißt, ich hänge beide Schläuche in meinen Gefäß,
indem ich das Wasser drin habe.
Und gehe wieder mit dem Gerät auf Templates,
dann Application Template, dann System Wash Method,
da muss ich wieder sowohl Schlauch als auch Schlauch
B anwählen,
drücke auf okay
Und jetzt werden wieder erst Puffer B oder Schlauch B und dann Schlauch A
gepumpt mit Wasser. Das Spiel mit Wasser ist fertig.
Und jetzt hänge ich die Schläuche in Itanol rein.
Geh wieder auf mein Application Template auf Systemwash Method,
wie die beiden Schläuche an.
Und los geht's. Das Pumpen Itanol ist jetzt auch fertig
Ganz zum Schluss muss ich noch die U-Forderung wieder ausschalten,
ganz wichtig, dass die nicht die ganze Zeit an ist.
Dazu gehe ich wieder auf Set Parameters
und schalte die Lampe aus und damit unsere Putinreinigung beendet