Musik Heute werden wir zusammen eukariotische Zellen mithilfe von Trypsin,
von der Zellkulturschale ablösen,
mithilfe einer Zellkammer die Zellzahl bestimmen und die Zellen,
die alle definierte Anzahl von Zellen auf eine neue Zellkulturschale aussehen.
Zellkulturen, eukariotische Zellkulturen sind relativ empfindlich, vor allem,
weil die sich viel langsamer teilen als Bakterien.
Das Nährmedium, in dem die leben,
für Bakterien aber auch ein sehr gutes Nährmedium ist.
Und deswegen muss man mit Zellkulturen sehr steril arbeiten,
unter so einer Cleanbanch,
damit eben keine Bakterien in die Zellkulturschale mit reinkommen,
weil die
die Bakterien eben sonst überwachsen würden
In diesen Zerkulturbänken gibt es verschiedene Modelle,
die alle auch ein bisschen unterschiedlich aufgebaut sind.
Aber das Prinzip ist eben, dass man hier eine Glasscheibe hat.
Wenn man die dann angemacht hat, dann etabliert sich hier so ein Luftvorhang,
durch den dann quasi keine Keime rein oder rauskommen können.
Also wir schalten die Zellkulturbank an. Wie gesagt, gibt
es unterschiedliche Modelle. Unsere werden mit einem Brot angeschaltet.
Dann ertönt ein Alarmsignal, das kann man quittieren.
Jetzt müssen wir eine Minute warten, bis der Luftvorhang
sich etabliert hat. Bevor wir die Scheibe dann in die
Arbeitsposition hochfahren können
Okay, jetzt nach einer Minute hat dieser Luftverhang sich etabliert,
dann gibt die Zeltkulturbanken Signalton, den man auch nicht mehr quittieren kann.
Jetzt wird sie elektronisch hochgefahren. Bist du die Arbeitsposition erreicht
hat und dann hört es auch auf zu piepen?
Weil das eben nicht luftdicht abschließt hier,
müssen wir erstmal die Oberflächen der Zellkulturbank mit 70 Prozent
den Meter 0 abwischen,
um das eben so steril
wie möglich
zu machen
Nächstes kontrolliere ich dann immer, ob die Kollegen,
die an der Werkbank arbeiten, die auch so hinterlassen haben,
wie man das gerne möchte.
Zum Beispiel haben wir immer diese serologischen Pipetten unter der Werkbank
und da ist jetzt nur noch eine drin.
Deswegen, das sind da noch mehr drunter. Auch die werden
mit Ethanol abgesprüht. Grundsätzlich ist es ganz hilfreich im Vorfeld,
alles vorzubereiten und alles unter die Werkbank zu holen,
was man braucht,
weil Zellkulturen relativ empfindlich sind und am liebsten in ihrer Umgebungstemperatur
von 37 Grad bleiben
Bestimmte Dinge haben wir immer schon unter der Werkbank,
wie zum Beispiel diese serologischen Pipetten,
Spitzen für Mikroliter Pipetten oder auch dieser sterilisierten Glaspasturpipetten,
mit denen wir das Medium aus den Zellkulturschalen absaugen können.
Andere Dinge muss man sich dann unter die Werkbank holen,
weil die außerhalb der Werkbank sind.
Zum Beispiel brauchen wir eine elektronische Pipetierhilfe. Wie gesagt,
alles, was unter die Werkbank kommt,
wird mit 70-prozentigen Ethanol sterilisiert.
Weil wir Zellen zählen wollen,
brauchen wir
auch Mikroliterpiepetten
Dann brauchen wir eine Absaugpumpe oder eine Absaughilfe,
die mit einer Vakuumpumpe verbunden ist,
wo dann eben diese Glaspass für Pipatton draufkommen.
Und wir brauchen ein 50-Milliter-Röhrchen,
in das wir die Zellen nach dem Tripsinieren überführen werden.
Jetzt können wir
das Medium warmstellen
Ungefähr eine halbe Stunde, bevor man mit den Zeltkulturarbeiten anfängt,
sollte man sich die Medien und Enzyme, die man braucht,
warmstellen bei 37 Grad, weil Zeltkulturen relativ empfindlich sind und
nicht gerne mit Zeug direkt aus dem Kühlschrank in Kontakt kommen.
So, jetzt brauchen wir noch das vorgewärmte Medium und das
vorgewärmte Trezin aus dem Wasserbad. Das wische ich immer,
bevor ich sterilisiere mit ein bisschen Graupapier trocken,
weil man ja sonst den Alkohol verdünnen würde,
mit dem
man das desinfiziert
Und der dann nicht mehr so eine sterilisierende Wirkung hätte.
Auch das wird dann desinfiziert, bevor es unter die Werkbank kommt.
Laborarbeit hat immer ganz viel mit Routine zu tun und eine meiner Routinen in der Zellkultur ist,
dass ich mir alles, was ich, alle Gefäße,
die ich habe, schon mal die Deckel anschraube,
weil man nämlich dann später nicht das Problem hat,
dass man möglicherweise schon die Biblitierhilfe in der Hand hat mit einer aufgesteckten Pipette und einem dann auffällt,
dass man noch so ein Gefäß aufschrauben muss,
was mit einer Hand manchmal ein bisschen kompliziert ist.
Wenn man sich angewöhnt,
die Gefäße alle gleich am Anfang anzuschrauben,
dann passiert das nicht
So, jetzt habe ich alles, was ich brauche.
Jetzt können wir loslegen. So, die aukkariotischen Zellen werden
in einem sogenannten CO2-Inkubator oder Brotschrank kultiviert unter Bedingungen,
unter denen sie sich am wohlsten fühlen.
Das sind eben 37 Grad Körpertemperatur, 5 Prozent CO2 und
95 Prozent Luftfeuchtigkeit. Die Luftfeuchtigkeit wird dadurch erreicht,
dass im Boden des Inkubators Wasserreservoir ist.
Jetzt können wir uns die Zellen mal rausholen und unter Mikros
prob anschauen.
Das Zellkulturmedium ist rot
Das ist ein Farbstoff, der bei unter sauren Bedingungen zu gelb umschlägt.
Das heißt, man sieht schon auf den ersten Blick,
ob es den Zellen noch gut geht oder ob sie vielleicht
zu dicht bewachsen sind oder durch Bakterien kontaminiert sind.
Wir haben hier bei uns in der Zellkultur nur adhärente Zelllinien.
Adhärent heißt, dass die am Boden der Festzellkulturschale fest kleben sozusagen.
Im menschlichen Körper werden das zum Beispiel Haut oder Gewebeorgane.
Es gibt auch Suspensionszirkulturen, zum Beispiel Blut.
Jetzt können wir uns die Zellen unter Mikroskop anschauen
Eh. Die meisten Zelllinien, mit denen im Labor
gearbeitet wird, sind immotalisiert, zum Beispiel Krebszelllinien.
Das ist ja das Problem an Krebs, dass die eben
immer weiter sich teilen und nicht irgendwann den programmierten Zelt tot,
die Abruptose eingehen. Man kann Zellen auch anders immotalisieren,
zum Beispiel durch Infektionen mit einem Virus. Dadurch,
dass die sich immer weiter teilen,
müssen wir eben das machen,
was wir heute machen,
nämlich die Zellen vom Boden der Zirkulturschale ablösen und dann eine
kleinere Anzahl von Zellen auf eine neue Zirkulturschale aussehen
und der Rest wird dann verworfen
Man nennt das Konfluenz,
also wenn die Zellen die gesamte Wachstumsoberfläche der Zellkulturschale bedecken,
dann sind sie zu 100 Prozent konfluent.
Das sollten sie eigentlich nicht sein, weil sie sich dann
irgendwann nicht mehr wohlfühlen. Normalerweise splitten wir die Zellen oder
passsagieren die Zellen bei einer Konferenz von ungefähr 80 bis 90 Prozent.
Und das haben diese Zellen im Moment auch. Die Zellen,
die wir heute splitten, ist eine Krebszellinie,
und zwar eine Knochenkrebszellinie. Es gibt, wie gesagt,
auch viele andere Krebszelllinien, die im Labor kultiviert werden und
für Experimente benutzt werden
Also, grundsätzlich ist es wichtig, den Raum,
den man unter der Zellkulturbank hat, auszunutzen.
Deswegen schiebe ich immer das, was ich gerade nicht brauche.
In dem Fall zum Beispiel das Medium, möglichst weit weg.
Zweitens sollte man bei der Zellkultur darauf achten,
dass man nicht mit den Händen oder den Armen über geöffnete Gefäße greift,
damit eben keine Bakterien von Kittelärmel in die Zellkulturschale oder in diese Lösungen,
die ja auch alle steril sind, reinfallen.
Wir lösen jetzt die Zellen mit Hilfe von Trypsin,
von der Zellkulturschale ab, das Trypsin ist ein Enzym,
das die Zell Oberflächenproteine, anverdaut.
Und dadurch können wir dann die Zellen von der Zerkulturschale ablösen.
Zu diesen Zwecke stecke ich hier so eine Pass-Derby-Pette auf die Absaughilfe.
Hier gibt es so einen Hebel, wenn man den drückt,
dann zieht eben das Vakuum die Flüssigkeit hoch.
Man macht die Schalen auch immer nur so weit auf,
wie es gerade nötig ist. Und saugt dann eben mit
dieser Glaspas-Derby-Pette das alte Medium ab. Wenn man angefangen hat,
mit den Zellen zu arbeiten, sollte man relativ zügig arbeiten,
weil den Zellen das natürlich nicht gut gefällt,
dass sie jetzt ohne Medium sind.
Der nächste Schritt ist, die Zellen mit PBS zu waschen,
PBS, ist eine Phosphate, gepufferte Salzlösung. Das hat den Hintergrund,
dass in dem Medium diverse Zusätze sind, unter anderem fitales Kälberserum,
was auch viele Proteine enthält und dann quasi diese Proteine,
das Tropsin, daran hindern würden, die Oberflächenproteine der Zellen zu verdauen.
Das saugt man dann auch wieder ab und gibt für so
eine 10-Zentimeter-Schale einen Millililiter Der Truppsinn EDTA-Lösung auf die Zellen.
So, nachdem wir das Truppsinn jetzt auf den Zellen haben,
stellen wir sie wieder in den Brotschrank,
weil das Truppsinn als Enzym eben auch bei 37 Grad am besten funktioniert.
Die Inkubationszeiten sind für verschiedene Zelllinien unterschiedlich lang,
je nachdem wie klebrig die sind.
In dem Fall müssen wir etwa fünf bis zehn Minuten warten,
bis die Zellen sich abgelöst haben und kontrollieren das dann
gleich unter Mikroskop
In der Inkubationszeit kann man dann schon mal anfangen,
die Zählkammer vorzubereiten. Die Zählkammer ist im Prinzip ein Objektträger.
In dem Fall ist das übrigens eine Neubauerzählkammer.
Es gibt auch noch andere Typen. Das ist ein Objektträger,
wo hier in diesen beiden Bereichen,
das sieht man jetzt mit dem bloßen Auge nicht,
Linien im Kreuz im Prinzip eingeätzt ist.
Und diese Kreuze haben eine definierte Größe, nämlich,
also da entstehen Quadrate, die eine definierte Größe haben,
nämlich von 0,0025 Quadratmillimeter.
Dann sind hier diese beiden Stege, Plan geschliffen.
Dazu gehört ein spezielles Deckläschen
Und wenn man das Deckläschen dann auf den Stegen liegen hat,
ist der Abstand zwischen dem mittleren Bereich und dem Deckläschen 0,1 Millimeter.
Das sagt die Tiefe aus,
sodass man quasi ein definiertes Volumen hat und sich daraus berechnen kann,
wie viele Zellen pro Mikrolitter oder pro Millilitter in unserer Zellsuspension drin sind.
Um das Deckläschen auf der Zählkammer zu befestigen, kann man
ein bisschen von dem 70-prozentigen Ethanol nehmen und die Stege damit befeuchten.
Und dann das Deckläschen,
drauflegen und ein bisschen hin und her schieben, weil sich dadurch,
dass das Glas speziell geschliffen ist und die Stege speziell geschliffen sind,
saugt sich dieses Decklas auf den Stegen fest.
Und da sieht man dann, das kann man dann daran erkennen,
dass sich sogenannte Newtonschen Ringe bilden. Um dann zu kontrollieren,
ob das Decklas auch richtig drauf sitzt,
damit eben auch dieser definierte Abstand eingehalten wird,
kann man das den Objektträger mal umdrehen, dann darf das Deckglas nicht abfallen.
Sollte man die andere Hand runterhalten, falls es doch abfällt.
Wir sind nämlich relativ teuer. So, jetzt schauen wir
mal, ob die Zellen sich schon abgelöst haben.
Man kann dem auch ein bisschen nachhelfen, indem man so
ein bisschen mit der Hand gegen die Zellkulturschale klopft.
Und wenn man die dann so hin und her schwenkt,
dann sieht man in einem bestimmten Winkel tatsächlich auch schon,
ob sie sich abgelöst haben oder nicht, weil dann eben so schlieren quasi sich bewegen.
Aber wir schauen uns natürlich auch nochmal unter dem Mikroskop an
Ja, also die Zellen haben sich abgelöst, schwimmen.
Die nehmen dann auch eine andere Form an.
Also vorher waren sie ja mehr so ein bisschen dreieckig.
Jetzt sind sie abgerundet, dadurch,
dass eben die Oberflächenproteine anverdaut sind.
Und könnt ihr euch ja
mal anschauen
So, nachdem die Zellen sich also jetzt abgelöst haben,
können wir weitermachen. Zu diesem einen Milliliter Tripsin,
was ich auf die Zellen gegeben hatte,
was ich ja immer von der Größe der Schade abhängig ist,
mit der man arbeitet, wie viel man nimmt,
gebe ich jetzt neun Milliliter Zellkulturmedium.
Das hat vor allem erstmal den Zweck, dass Tripsin ein bisschen zu verdünnen,
weil das eben jetzt nicht weiter an den Oberflächenproteinen verdauen soll.
Und weil manchmal noch Zellen an der Oberfläche der Zellkulturschale haften,
hipitiere ich jetzt die Zellen,
oder die Zellsuspension ein paar Mal schon in der Schale auf und ab.
Das sollte man immer ein bisschen vorsichtig machen,
damit nicht so viel Schaum entsteht.
Den Schaum mögen die Zellen auch nicht so besonders.
Und überführe jetzt also diese gesamten zehn Milliliter.
In ein 50-Milliliter-Röhrchen. Weil die adhärenten Zellen sich nicht nur
an der Zell-Kulturoberfläche, sondern auch aneinander festklammern.
Wir die aber jetzt zum Zellen in der Zellkammer
möglichst vereinzelt haben wollen
Die zählen jetzt also mindestens zehnmal rauf und runter,
um die eben möglichst zu vereinzeln und möglichst gleichmäßig in der Suspension zu haben.
Danach nehme ich Zehn Mökolitern. Der Zellsuspension. Ich pipediere
die zehn Mökoliter Zellsuspension an den Rand zwischen Backglas und Objektträger.
Auf einen der mittleren Stege. Und das zieht sich dann
durch Kapillarkräfte unter das Deckglas. Hier ist mal ein Ausdruck
von dem, was wir nachher im Mikroskop sehen werden.
Also das ist quasi ein Kreuz von so einer Neubauerzellkammer.
Die Zellkammer kann man auch für kleinere Zellen zum Beispiel rote Blutkörperchen benutzen.
Da benutzt man dann diese inneren, kleineren Quadrate.
Wir nehmen aber zur Erzählung dieser größeren Zellen die äußeren Quadrate.
Das sind die sogenannten Großquadrate. Die bestehen immer aus
viermal vier Quadraten und wir zählen auch alle vier Großquadrate aus
und bilden nachher den Mittelwert aus dem vier Großquadraten und bestimmen dann die Zellzahl.
Beim Zellen ist zu beachten, dass man in einer bestimmten Richtung zählt,
meistens mehrenderförmig, also von links oben nach rechts unten.
Und dass man zweitens sich eine Regel ausdenkt,
dass man meine Regel ist, nur die Zellen,
die Links auf der Linie und oberhalb der Linie
Sind zu zählen und nicht die zu zählen,
die unten auf einer Linie sind oder rechts auf einer Linie,
weil man sich natürlich nicht merken kann,
wenn man jetzt hier angekommen ist,
ob man die Zelle auf der Linie schon mitgezählt hat oder nicht.
Und wenn man eine Zellregel hat, dann ist das völlig klar.
So, und jetzt können wir uns das Ganze
mal unter den Mikroskop anschauen. So,
jetzt zählen wir also die Zellen unterm Mikroskop mit Hilfe dieser Zelluhr,
bei jedem Druck springt die um eine Position weiter,
damit man sich das nicht merken muss
Und wie gesagt, zählen wir alle vier Großquadrate.
In dem Großquadrat waren jetzt also 34 Zellen. Wenn man feststellt,
dass man mehrere hundert Zellen in einem Großquadrat hat,
kann man sich natürlich die Zellsuspension auch verdünnen,
damit das Zellen ein bisschen schneller vonstatten geht.
Dann geht man ins nächste Großquadrat,
stellt die Zelluhr auf null zurück
Und fängt wieder an zu zählen.
In dem Großquadrat waren jetzt 39 Zellen,
wenn die Zahlen zu dicht voneinander zu sehr voneinander abweichen,
heißt das, dass die Zelldispensionen schlecht durchmischt war,
dann sollte man die Zellkammer nochmal neu befilmen und
nochmal neu anfangen zu zählen
32 Zellen. Und nochmal 32 Zellen. Mithilfe eines Taschenrechners
Willen wir also den Mittelwert? 34 plus 39. Das sind
34 Zellen, pro Großquadrat. Und die Regel,
das kann man sich natürlich auch alles ausrechnen,
da man ja die Fläche eines Quadrates kennt und die Höhe des Leckglases.
Die Regel für diese Kammer lautet,
die Zahl pro Großquadrat multipliziert mit 10,
ergibt die Zellzahl pro Mikroliter.
Wir haben also jetzt
340 Zellen pro Mikroliter
Wir wollen jetzt 200.000 Zellen aussähen auf eine neue 10 Zentimeter Schale. Das heißt,
wir müssen 200.000 durch 340 Teilen und brauchen demnach 588 Mikroliter,
um 200.000 Zellen auf die neue 10 Zentimeter Schale auszusähen.
Nachdem wir jetzt bestimmt haben,
wie viele Zellen oder wie viele Mikroliter wir brauchen,
um eine definierte Zellzahl auszusähen,
werden wir das jetzt auch tun,
in eine neue 10 Zentimeter Zellkulturplatte
Wichtig ist natürlich immer, die so zu beschriften,
dass man sie nicht miteinander verwechseln kann. Das heißt,
man muss auf jeden Fall den Namen der Zellinie draufschreiben.
Die Passagenummer, also in der wievielten Passage sich die Zellen befinden,
also wie oft die schon koptioniert worden sind und auf eine
neue Schale gekommen sind.
Das ist in dem Fall die Passage 9. Das Datum.
Und das eigene Kürzel, weil mehrere Menschen gleichzeitig diesen Brutschrank verwenden,
damit man da eben auch die Zellen nicht
miteinander verwechseln kann
In vielen Laboren werden Zellen auch nur bis zu einer bestimmten Passagenzahl verwendet.
Auch wenn die sich immer weiterteilen, verändert sich oftmals
die Morphologie der Zellen. Und deswegen werden für Experimente oftmals
Zellen nur bis zu einer bestimmten Passagenummer verwendet für Experimente.
Wenn man Zellen jetzt gerade nicht für Experimente braucht,
dann hält man die auch normalerweise eben nicht in Kultur,
damit sie eben nicht so schnell in der Passagenzahl hochgehen,
sondern friert die dann in flüssigem Stickstoff ein und taute auf,
wenn man so wieder braucht.
Jetzt lege ich
zehn Milliliter frisches Medium
In die neue beschriftete Zellkulturschale vor.
Pipetiere die Zellsuspension noch ein paar Mal rauf und runter,
weil die Zellen auch der Schwerkraft folgen und in der Zeit,
in der wir jetzt gezählt haben,
sich auf den Boden des Gefäßes abgesetzt haben,
um die also nochmal zu durchmischen.
Pipetiere ich sie noch
ein paar Mal rauf und runter
Und pepertiere, dann die 588 Mikroletter,
die wir vorhin ausgerechnet haben. In die neue Zerkulturplatte.
Jetzt schwenke ich die Schale noch ein bisschen,
damit eben die Zellen sich auch gleichmäßig in der Schale verteilen.
Und dann kommen die Zellen wieder in den CO2-Inkubator
So, die Zellen sind jetzt schon wieder im Inkubator.
Die hätten wir uns natürlich jetzt auch noch mal unter
dem Mikroskop anschauen können, um festzustellen,
dass sie natürlich nach wie vor diese Kugelrunde Form haben und rumschwimmen.
Das dauert ungefähr zwölf Stunden, bis die sich dann wieder
abgesetzt haben auf dem Boden der Zellkulturschale und sich dann auch wieder angeheftet haben.
Und jetzt müssen wir nur noch aufräumen. Sämtlicher Müll,
der in der Zellkultur anfällt, wird autoklaviert,
das heißt sterilisiert im strömenden Wasserdampf bei 121 Grad
unter Überdruck und 20 Minuten
Auch der flüssige Abfall,
der also in dieser Flasche von der Sterilpumpe landet,
der Rest der Zellsuspension wird verworfen und dann wird der flüssige Abfall Auto klaviert.
Die Pasteur Piepetten werden auch Auto klaviert und sämtlicher Plastikmüll
auch dafür. Gibt es diese Mülltonnen? Alles,
was ich unter die Hut gebracht habe,
tue ich unter der Hut
wieder raus
Medium mit dem Kühlschrank. Abfall in den Autos Klaviermüll.
Und am Ende, wenn ich alles aufgeräumt habe,
wische ich nochmal mit 70-prozentigem Ethanol Und jeder oder in vielen
Zellkulturhutz, oh. Gibt es dann noch diese UV-Lampen,
die man auch noch zur Sterilisation einsetzen kann?
Weil Bakterien durch UV-Licht zerstört werden.
Und dann macht man
die Werkbank zu
Und ist fertig. Am Ende reinigen wir noch die Zählkammer.
Die werden natürlich wiederverwendet. Deswegen konnten wir auch die Zählkammer
übrigens außerhalb der Hood vorbereiten, weil eben die Zellen,
die in der Zählkammer zum Zellen drin waren,
auf jeden Fall verworfen werden und deswegen nicht steril bleiben müssen.
Da kann man dann also auch mit 70 Prozent in Ethanol
das Deckläschen und den Objektträger reinigen
Zurück in die Verpackung tun